【摘要】 研究背景：N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)和N-羥基神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)是哺乳動物中最常見的唾液酸,但人類在進化過程中由于CMAH基因的突變,自身只能合成Neu5Ac。Neu5Ac是母乳中的重要成分,同時也是大腦中神經(jīng)節(jié)苷脂的構(gòu)成組分,在人體中,腦組織中唾液酸的含量最高,嬰幼兒主要通過母乳攝入Neu5Ac以維持腦發(fā)育。記憶力作為神經(jīng)系統(tǒng)功能之一,表現(xiàn)在對外界刺激的反應(yīng)程度和神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)速度。這種信息傳遞以及神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)必須通過突觸來實現(xiàn),可見穩(wěn)定的突觸連接是記憶力形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),多項研究證實唾液酸是作用于大腦細(xì)胞膜及突觸的營養(yǎng)素,并且在神經(jīng)系統(tǒng)中擔(dān)負(fù)著特殊的使命,可促進神經(jīng)細(xì)胞的分化、發(fā)育和神經(jīng)再生的作用,參與突觸傳遞、維持細(xì)胞的正常機能,參與學(xué)習(xí)與記憶的過程。因此,攝入足夠的唾液酸對于嬰兒腦功能的正常發(fā)育尤其重要。在一項對于母乳喂養(yǎng)兒和人工喂養(yǎng)兒的比較研究中發(fā)現(xiàn),母乳喂養(yǎng)兒唾液中唾液酸的含量比人工喂養(yǎng)兒高。近年來,唾液酸對于嬰幼兒腦發(fā)育的重要生理作用受到越來越多的關(guān)注,但是相關(guān)的基礎(chǔ)研究多限制在嚙齒類動物體內(nèi)進行。本諜題的創(chuàng)新之處在于采用與人類腦發(fā)育過程相似的仔豬模型,研究唾液酸的攝入對仔豬學(xué)習(xí)和認(rèn)知的影響,并探索其背后可能的分子機制,為唾液酸的營養(yǎng)功能提供進一步的科學(xué)依據(jù)。研究目的：通過測量38日齡仔豬海馬神經(jīng)細(xì)胞的分布及數(shù)目,來探索唾液酸攝入對神經(jīng)細(xì)胞的影響；通過測量38日齡仔豬海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達,檢測唾液酸對BDNF含量的影響。研究方法：本實驗將29只3日齡雄性仔豬隨機分為對照組(n=15)和唾液酸處理組(n=14),并以配方奶連續(xù)喂養(yǎng)35天。其中對照組的唾液酸為奶粉中原有量,未額外添加,唾液酸的含量為Neu5Ac:77.7±1.6mg/100g奶粉；處理組唾液酸的含量為Neu5Ac:486.8±35.2mg/100g奶粉。仔豬于39口齡時麻醉處死取材,采用免疫熒光方法研究唾液酸攝入對海馬神經(jīng)細(xì)胞可塑性、成熟神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞)和增殖細(xì)胞分布與表達的影響,并采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測兩組仔豬海馬中BDNF含量,從而推測唾液酸對仔豬海馬BDNF的影響。研究結(jié)果：(1)膳食添加唾液酸對仔豬體重和腦重?zé)o明顯影響；(2)處理組海馬齒狀回中多聚唾液酸(PolySia-NCAM)的表達量比對照組有所增加,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；(3)神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)主要在齒狀回的顆粒細(xì)胞、Hillus區(qū)、阿蒙角的椎體細(xì)胞層中表達,處理組與對照組的NeuN陽性細(xì)胞個數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,提示唾液酸的攝入對成熟神經(jīng)元的數(shù)口無顯著影響；(4)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)在齒狀回的表達分布與PolySia-NCAM分布呈現(xiàn)協(xié)同的趨勢,主要存在于顆粒細(xì)胞層中,由此可見PolySia-NCAM在星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上有表達。比較不同組間齒狀回GFAP與PolySia-NCAM的熒光強度(IOD/Area),兩組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但是處理組有增高的趨勢；(5)Ki-67標(biāo)記的新生細(xì)胞主要位于仔豬齒狀回顆粒細(xì)胞下層,對38日齡仔豬Ki-67陽性細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果顯示處理組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；(6)采用ELISA方法測定仔豬海馬組織中BDNF含量,處理組的含量相對于對照組有增高的趨勢,但結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：唾液乳糖的攝入對仔豬海馬齒狀回成熟神經(jīng)元、新生細(xì)胞的數(shù)目無顯著影響,但可能通過增加齒狀回的可塑性及星形膠質(zhì)細(xì)胞、增加BDNF的含量,進而影響學(xué)習(xí)與記憶的通路。 

1.前言

1.1唾液酸
唾液酸是一類天然糖類化合物，最早由Blix等[4]從牛下頌唾液腺粘蛋白中分離得到，因此命名為唾液酸。后來的研究表明它的結(jié)構(gòu)是0，N-二乙酰神經(jīng)氨酸[5]，Klenk等將其命名為神經(jīng)節(jié)苷脂（Ganglioside)[6]，繼續(xù)分離純化出結(jié)晶后為多輕基氨酸，并命名為神經(jīng)氨酸（Neuraminic acid),現(xiàn)已分析出該組分為脫乙酰唾液酸甲醇酯。唾液酸類化合物是以九碳糖神經(jīng)氨酸(5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactononulsonic acid)為基本結(jié)構(gòu)的一族衍生物的總稱，目前已發(fā)現(xiàn)50多種天然存在的唾液酸，其中N-乙酰神經(jīng)氨酸（2-keto-S-acetamido-SjSdideoxy-D-glycero-D-galactononulsonic acid，Neu5Ac， NANA,圖1.1.1.1 A)是人體中最常見的存在形式⑴。當(dāng)N-乙酷基被輕化之后生成N-輕基乙酰神經(jīng)氧酸（N-glycolylneuratninic acid, NeuSGc,圖 1.1.1.1 B)，存在于除人類之外的哺乳動物，如馬、牛、大獲獲等。1988年Inoue等人在精液和鮭魚卵中發(fā)現(xiàn)C5氨基被經(jīng)基取代的另一種唾液酸形式脫氨基神經(jīng)氨酸（ketodeoxynonulosonic acid, KDN,圖 1.1.1.1 C)。

1.2學(xué)習(xí)與記憶
由于判斷標(biāo)準(zhǔn)不同，記憶的分類至今仍然在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域里存在很大爭議。記憶的分類方法較多，根據(jù)記憶的時程可將其分為短時記憶（short-term memory, STM)和長時程記憶（long-term memory,LTM),短時記憶-I般持續(xù)幾秒到幾小時，且易于破壞，而長吋程記憶是指經(jīng)過幾天、幾月甚至幾年仍然能再現(xiàn)的記憶根據(jù)信息的儲存和再現(xiàn)方式可分為陳述性記憶（declarative memory)和非陳述性記憶（non-declarative memory)。前者是對事實、事件以及它們之問相互關(guān)系的記憶,可以通過有意識的回憶獲取，例如用語言描述被記憶的內(nèi)容，后者需耍有意識的回憶就能獲取，包括程序性記憶（技巧或習(xí)慣的記憶）、啟動效應(yīng)（如辨認(rèn)曾經(jīng)經(jīng)歷過的刺激）、聯(lián)合型學(xué)習(xí)(條件反射）和非聯(lián)合型學(xué)習(xí)（習(xí)慣化和敏感化）[64]。學(xué)習(xí)與記憶密不可分，它們共同改變著大腦內(nèi)神經(jīng)元群的活動。其生理機制一直是現(xiàn)在神經(jīng)科學(xué)的研究重點和熱點。
.........

2.材料與方法

2.1實驗儀器
冷凍切片機 美國Leica，CM1900
焚光顯微鏡 尼康，80i
共聚焦顯微鏡 日本奧林巴斯，
FV1000低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器
超低溫冰箱 海爾全自動酶標(biāo)儀 
Thermo，Varioskan FlashPAP免疫組化筆 福州邁新生物有限公司

2.2實驗試劑
戊巴比妥鈉 Sigma
PBS緩沖液 武漢博士德生物有限公司，
AR0030
NeuN 抗體 Novus Biologicals，NBP1-92716
GFAP 抗體 Abcam，bl04455
PolySia-NCAM 抗體 Millipore，MAB5324
Ki-67 抗體 Millipore，AB9260
牛血清白蛋白 北京元亨圣馬生物技術(shù)
OCT 組織包埋膠 SakuraFinetek，4583
山羊抗小鼠（Alexa Fluo 488) Jackson ImmunoResearch，115-545-146

2.材料訪法 ..............22
2.1實驗儀器 ...............22
2.2實驗試劑...................... 22
3.結(jié)果.........................28 
3.1唾液酸對仔豬體重與腦重的影響............ 28
3.1.1唾液酸攝入對仔豬體重的影響 .............28
3.1.2唾液酸攝入別仔豬腦重的影響................... 30 
4.討論........42 
4.1唾液酸的攝入對仔豬體重及腦重的影響 ..............42
4.2唾液酸對仔豬海馬BDNF表達水平的影響 ............................42

3.結(jié)果

3.1唾液酸對仔豬體重與腦重的影響
3日齡雄性仔豬從豬場運回實驗室，平均體重2.27±0.1kg，飼養(yǎng)至38曰齡后平均體重達9.25±0.39 kg，組間平均體重均無顯著性差異（P>0.05)。仔豬每日的體重記錄如表3.1.1，飼養(yǎng)初期仔豬可能因為飲食的突然改變（母乳轉(zhuǎn)變?yōu)榕浞侥蹋┏霈F(xiàn)吐奶、厭奶及腹灣的現(xiàn)象，因而第一周仔豬的體重增長趨勢緩慢，每曰平均增長0.046kg,第二周逐漸適應(yīng)配方奶，體重增長速度加快，每日平均增長0.104kg，之后仔豬體重呈正常的指數(shù)性生長，增長趨勢如圖3.1.1所示。我們的研究結(jié)果顯示，唾液酸對仔豬體重?zé)o明顯的影響，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，T 檢驗）。
39日齡時對仔豬注射致死劑量的戊巴比妥鈉（lOOmg/kg，Sigma公司），取腦后稱全腦重量，平均腦重55.98 ± 0.82 g，平均腦體比為6.29 ± 0.23 g腦重/kg體重，兩組間的腦重與腦體比接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（T檢驗，P>0.05)。

3.2唾液酸的攝入對仔豬海馬BDNF水平的影響
釆用ELISA方法測定仔豬海馬組織中BDNF含量，BCA蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3.2.1，BDNF標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3.2.2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出的結(jié)果顯示（圖3.2.3),對照組仔豬海馬組織中BDNF的含量為51.95 pg/mg protein，唾液酸處理組為53.40 pg/mg protein，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（兩獨立樣本T檢驗，P=0.902)。
多聚唾液酸（Polysialic acid)己被證實與祌經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育及突觸可塑性等息息相關(guān)，在早期發(fā)育階段的未成熟神經(jīng)細(xì)胞中廣泛表達，并隨著分化過程而慢慢減少，已有相關(guān)研究報道，腦組織中的海馬齒狀回顆粒下區(qū)（subgranular zone,SGZ)與室管膜下區(qū)（subventricu丨arzone, SVZ)終生具備神經(jīng)發(fā)生的能力。本實驗我們采用免疫熒光方法檢測仔豬海馬內(nèi)多聚唾液酸在不同組間的表達差異。圖3.3.1勞光結(jié)果顯示，與先前在哨?類動物體內(nèi)的研究描述相同，在海馬齒狀回（Dentate gyms, DG)的顆粒細(xì)胞(Granular cell layer, Gr)、阿蒙角（Comuammonis, CA)的椎體細(xì)胞層（pyramidale layer, Py)均有 PolySia-NCAM 的表達，在齒狀回的分了-)5?達相對較弱且分散,阿蒙角的分了未見有陽性表達。各區(qū)域的表達如圖3.2.2。比較不同組間PolySia-NCAM的焚光強度（lOD/Area)如圖3.3.3，處理組PolySia-NCAM的表達相對于對照組有增高的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P〉0.05，T test)。

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4.討論

大腦發(fā)育最快也最關(guān)鍵的時期是出牛.前出生后早期，此時營養(yǎng)的攝入、吸收和轉(zhuǎn)化利用將對大腦的成熟有至關(guān)重耍的影響，如果此時營養(yǎng)攝入+足將會導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的遠(yuǎn)期不良后果。目前為止，相關(guān)研究尚未深入，而且唾液酸對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能的影響以及它在影響學(xué)習(xí)與記憶過程中存在的分子機制仍未徹底禍?zhǔn)尽４送庀嚓P(guān)研究多在噴齒類動物（如大鼠、小鼠）上進行，木研究則采用與人類在生理、解剖、腦發(fā)育等更接近的仔豬模型分別研究唾液酸的攝入對神經(jīng)細(xì)胞可塑性、成熟神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞）和增殖細(xì)胞的影響，以及對海馬BDNF蛋白表達的影響。

4.1唾液黢的攝入對仔豬體重及腦重的影響
通過記錄仔豬每口體重變化，可知其生長趨勢正常，組間平均體重?zé)o顯著性差異，仔豬39日齡處死時稱量腦重的結(jié)果顯示組問無統(tǒng)計學(xué)差異，說明兩組仔豬發(fā)育基本正常，發(fā)育程度也相似無較大差別，提示膳食添加唾液酸對仔豬體重和腦?無明顯影響。

4.2唾液酸對仔豬海馬BDNF水平的影響
近年來，對學(xué)習(xí)與記憶機制的研究很多集中在神經(jīng)營養(yǎng)因子及其信號通路，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子包括BDNF、神經(jīng)生長因子（Neuron Growth Factor, NGF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3 (Neurotrophin-3，NT-3),它們在腦組織巾廣泛表達，影響神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)與功能。其中BDNF足腦內(nèi)分布最廣的神經(jīng)營養(yǎng)因子，尤其以大腦皮層和海馬中含量最高，對神經(jīng)元的存活、突觸傳遞和突觸重塑有重要的調(diào)節(jié)功能。已有研究發(fā)現(xiàn)，在未成熟神經(jīng)元，BDNF及其受體TrkB調(diào)控祌經(jīng)元的增生神經(jīng)前體細(xì)胞和新生神經(jīng)元的分化成熟和生存等77]，還可促進神經(jīng)元的再生[78]，調(diào)控海馬的可塑性。

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