本文關(guān)鍵詞：上海私營電影院的社會主義改造（1949-1956），由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】鈣調(diào)磷酸酶是目前所知唯一受Ca2+/鈣調(diào)素調(diào)控的Ser/Thr蛋白磷酸酶,由一個催化亞基CNA和一個調(diào)節(jié)亞基CNB組成的異源二聚體。催化亞基CNA主要參與真菌的孢子形成及菌絲形態(tài),調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)陽離子平衡,細(xì)胞壁的合成及病原真菌致病性。課題組前期從昆蟲病原真菌球孢白僵菌中克隆了鈣調(diào)磷酸酶催化亞基Bbcna,發(fā)現(xiàn)Bbcna影響菌落形態(tài)、分生孢子產(chǎn)生以及影響白僵菌對殺真菌劑咯菌氰的敏感性。破壞Bbcna導(dǎo)致菌株毒力下降,并且與分生孢子疏水性和附著性下降和附著胞形成率下降密切有關(guān)(武增強(qiáng),2010)。另外,研究發(fā)現(xiàn)Bbcna突變體容易失活,推測Bbcna可能參與球孢白僵菌環(huán)境適應(yīng)性調(diào)節(jié)。有關(guān)Bbcna調(diào)節(jié)菌株生長發(fā)育、活力及細(xì)胞表面特性的生理生化機(jī)制,尚待進(jìn)一步明確。本論文通過重新構(gòu)建Bbcna破壞突變體,結(jié)合回復(fù)互補(bǔ),進(jìn)一步探究了Bbcna與菌株活力、發(fā)育分化及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及表面特性、毒力的關(guān)系及可能機(jī)制,并通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析Bbcna與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性(CWI)信號途徑Bbslt2的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：1.破壞Bbcna影響菌株生長發(fā)育破壞Bbcna基因影響了球孢白僵菌生長發(fā)育,導(dǎo)致分生孢子產(chǎn)生顯著降低,孢子活力下降。在完全培養(yǎng)基1/4SDAY與PDA和基本培養(yǎng)基CZM平板上,ABbcna的生長速率分別比野生菌株下降了16.23%、44.12%和28.57%。在1/4SDAY、PDA和CZM平板上,ABbcna的產(chǎn)孢量分別比野生菌株下降了43.68%、51.89%和22.23%。分生孢子萌發(fā)率檢測結(jié)果表明,破壞Bbcna延遲了孢子萌發(fā)速率,新鮮分生孢子萌發(fā)中時比野生菌株延長了2.5h左右。隨著貯存時間的延長,△Bbcna(?)舌力下降迅速。在4℃和26℃貯存40d,野生菌株的孢子活力分別為90.35%和92.08%,而△Bbcna的活孢率分別下降至33.32%和55.37%。分生孢子活性氧(ROS)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),△Bbcna孢子隨貯存時間的延長,胞內(nèi)ROS相對于野生菌株的水平則呈上升趨勢。由此推測,△Bbcna可能參與胞內(nèi)活性氧的調(diào)節(jié),影響菌株活力。2.Bbcna調(diào)節(jié)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性破壞Bbcna引起菌株對細(xì)胞壁合成抑制劑剛果紅的敏感性增強(qiáng)。剛果紅對ABbcna半抑制濃度為2.819mg/mL,顯著低于對野生菌株的半抑制濃度(4.642mg/mL)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),破壞Bbcna影響了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),細(xì)胞壁明顯變薄。細(xì)胞壁成分測定結(jié)果表明,破壞Bbcna導(dǎo)致細(xì)胞壁總糖含量和p-1.3以及p-1,6葡聚糖含量上升,而幾丁質(zhì)含量卻顯著下降。由此推測,Bbcna可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁組成,影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和完整性。3.Bbcna影響球孢白僵菌細(xì)胞表面特性疏水性測定結(jié)果表明,破壞Bbcna降低了分生孢子疏水性,突變體疏水性比野生菌株下降了41.54%。固體表面附著性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),ABbcna在疏水表面的附著性顯著低于野生菌株,而在親水表面的附著性卻顯著高于野生菌株。植物凝集素結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn),ABbcna對ConA(檢測葡聚糖)和WGA(檢測G1cNAc)結(jié)合明顯低于野生菌株,而對GNL(檢測α-甘露糖)的結(jié)合卻強(qiáng)于野生菌株。由此表明,破壞Bbcna影響了細(xì)胞表面疏水性、附著性和碳源表位。4.破壞Bbcna導(dǎo)致菌株毒力下降通過“經(jīng)典”的體壁接種和微量注射孢子至蟲體內(nèi)進(jìn)行生物測定,發(fā)現(xiàn)破壞Bbcna菌株毒力顯著降低。在相同接種劑量下(孢子濃度),體壁接種和注射接種的突變體對大蠟螟的LTso分別比野生型延長了19.87%和21.3%。由此表明,ABbcna是菌株毒力的一個重要影響因子。5.Bbcna和Bbslt2調(diào)控的差異表達(dá)基因分析在剛果紅脅迫條件下,與野生菌株相比,△Bbcna共有603個基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化,包括350個上調(diào)基因和253個下調(diào)基因；而細(xì)胞壁完整性信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)的調(diào)控因子△Bbslt2中共有102個基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化,包括31個上調(diào)基因和71個下調(diào)基因。與野生菌株相比,在△Bbslt2和△Bbcna中有8個基因共同上調(diào),32個基因共同下調(diào),分別占△Bbslt2中上調(diào)和下調(diào)基因的25.81%和45.07%。這些共同上調(diào)和下調(diào)的40個差異基因,涉及細(xì)胞壁合成、細(xì)胞膜代謝、氧化脅迫相關(guān)等生物學(xué)過程。由此表明,鈣調(diào)磷酸酶信號途徑(Bbcna)和Bbslt2途徑在調(diào)控球孢白僵菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性過程中存在明顯的交互作用(crosstalking)。
【作者】張世偉；
【導(dǎo)師】張永軍；
【作者基本信息】西南大學(xué)，微生物基因工程，2014，碩士
【關(guān)鍵詞】球孢白僵菌；鈣調(diào)磷酸酶；細(xì)胞壁完整性；毒力；

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