本文關(guān)鍵詞：西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白鑒定及功能研究

  更多相關(guān)文章： 西花薊馬 嗅覺相關(guān)蛋白 分子克隆 原核表達(dá) 表達(dá)譜 熒光競爭結(jié)合 免疫定位

【摘要】：昆蟲嗅覺系統(tǒng)在其覓食、尋偶、選擇產(chǎn)卵場所等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,參與此過程的蛋白主要有氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、氣味受體(olfactory receptors,ORs)、氣味降解酶(odorant degrading enzymes,ODEs)以及感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins,SNMPs)等。西花薊馬Frankliniella occidentalis(Pergande),又名苜蓿薊馬,隸屬纓翅目(Thysanoptera)薊馬科(Thripidae)花薊馬屬Frankliniella,目前已成為世界性的危險(xiǎn)性入侵害蟲。本研究通過開展西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因克隆、時(shí)空表達(dá)、蛋白表達(dá)純化、熒光競爭結(jié)合以及免疫定位研究,為西花薊馬更多嗅覺相關(guān)蛋白基因的發(fā)掘奠定基礎(chǔ),同時(shí)為闡明西花薊馬行為反應(yīng)本質(zhì)、與環(huán)境間的化學(xué)通訊提供理論依據(jù)。1.西花薊馬感器掃描電鏡觀察西花薊馬觸角中的感器主要有毛形感器(sensilla trichodea)、刺形感器(sensilla chaetica)、錐形感器(sensilla basiconica)、乳狀感器(mamillary sensilla);足上主要有毛形感器、刺形感器、錐形感器、吸耳球形感器(sensilla ear washing buob-shaped)、乳突感器(mamillary sensilla)、鐘形感器(sensilla campaniform)、B?hm氏鬃毛(B?hm bristle);復(fù)眼上只有1種刺形感器。2.西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因分子克隆成功克隆獲得4個(gè)西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因c DNA序列全長和1個(gè)基因c DNA序列片段,分別命名為Focc CSP1、Focc CSP2、Focc OBP1、Focc OBP2、Focc OR1,Gen Bank登錄號(hào)分別為KM527949、KM035415、KM527948、KM527950、KM527951。Focc CSP1、Focc CSP2、Focc OBP1、Focc OR1全長c DNA序列分別為597bp、521bp、660bp、1645bp,開放閱讀框分別為288bp、387bp、450bp、1374bp,分別編碼95、128、149、457個(gè)氨基酸,預(yù)測成熟蛋白分子量分別為11.377、14.51、16.388、51.19k Da,等電點(diǎn)分別為4.72、5.41、7.46、5.08,Focc CSP2和Focc OBP1的N-端分別含有19、22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。獲得Focc OBP2的c DNA序列880bp,通過生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)具有完整的開放閱讀框,ORF長591bp,編碼196個(gè)氨基酸,預(yù)測該成熟蛋白分子量為23.66k Da,等電點(diǎn)為7.41。3.西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因表達(dá)譜分析各基因在西花薊馬不同發(fā)育期的表達(dá)豐度差異較大,Focc CSP1在羽化1 d雌蟲中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次為2齡若蟲;Focc CSP2在1齡若蟲中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次為羽化1天的雌蟲;Focc OBP1在2齡若蟲和1齡若蟲中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次為羽化1天的雌、雄成蟲;Focc OBP2在2齡若蟲中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次為羽化1天的雌、雄成蟲;Focc OR1在羽化1 d雌蟲中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次為2齡若蟲、羽化1 d的雄蟲。各基因均在觸角中的表達(dá)量最高,Focc CSP1、Focc CSP2和Focc OR1均在觸角中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次為足;Focc OBP1基本上是在觸角中特異性表達(dá),在足、頭、胸等部位該基因表達(dá)甚微;Focc OBP2在觸角中表達(dá)量最高,在足部該基因也有少量表達(dá)。4.西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白的原核表達(dá)與純化成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-30a(+)/Focc CSP1、p ET-30a(+)/CSP2、p ET-30a(+)/OR1,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)及Ni柱純化,成功獲得不帶融合標(biāo)簽的目的蛋白Focc CSP1和Focc CSP2,分子量分別約為11 k Da和15 k Da,采用BCA蛋白濃度測定法測定了純化后目的蛋白的濃度,Focc CSP1蛋白濃度為1.455 mg/m L,Focc CSP2蛋白濃度為1.013 mg/m L,滿足后續(xù)試驗(yàn)的需要。5.西花薊馬化學(xué)感受蛋白Focc CSP2結(jié)合特性選用19種化學(xué)氣味分子作為配基測試了西花薊馬化學(xué)感受蛋白Focc CSP2的與各氣味分子的結(jié)合能力,以1-NPN作為熒光報(bào)告子,結(jié)合能力最強(qiáng)的是茴香醛,[IC50]值為11.3944μmol/L,與Focc CSP2的競爭結(jié)合常數(shù)KD為10.5047;其次為香葉醇,[IC50]值為15.3463μmol/L,KD為14.1480。相對(duì)結(jié)合能力中等有甲基水楊酸、煙酸乙酯、異煙酸甲酯、苯甲醛、乙基苯、香茅醇、香茅醛、正壬醛、芳樟醇,[IC50]從35.2426μmol/L逐漸上升到85.6408μmol/L,KD也從32.4906增加到78.9534。其余氣味物質(zhì)的相對(duì)結(jié)合能力較弱。6.西花薊馬化學(xué)感受蛋白Focc CSP1免疫電鏡定位通過免疫新西蘭大白兔制備了Focc CSP1蛋白抗體,透射電鏡觀察顯示,該蛋白抗體具有較強(qiáng)的免疫特異性,能與該蛋白很好的結(jié)合,并確切的反應(yīng)出該蛋白的分布。膠體金顆粒在西花薊馬觸角、感器、頭、足等部位淋巴液中都明顯標(biāo)記,可見該蛋白基因組織分布廣泛,與該基因基于q RT-PCR表達(dá)譜檢測結(jié)果吻合。推測該基因除了參與環(huán)境氣味物質(zhì)的識(shí)別、運(yùn)輸外,還可能參與感受機(jī)械刺激、調(diào)節(jié)生長發(fā)育或其它重要的生理功能。
【關(guān)鍵詞】：西花薊馬 嗅覺相關(guān)蛋白 分子克隆 原核表達(dá) 表達(dá)譜 熒光競爭結(jié)合 免疫定位
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S433.89
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 英文縮略表14-15
• 第一章 引言15-24
• 1.1 昆蟲氣味結(jié)合蛋白16-20
• 1.1.1 氣味結(jié)合蛋白的種類17
• 1.1.2 氣味結(jié)合蛋白OBPs的表達(dá)分布17-18
• 1.1.3 氣味結(jié)合蛋白OBPs的三維結(jié)構(gòu)研究18-19
• 1.1.4 氣味結(jié)合蛋白OBPs的功能研究19-20
• 1.2 化學(xué)感受蛋白CSPS研究進(jìn)展20-21
• 1.2.1 昆蟲化學(xué)感受蛋白序列基本特征20
• 1.2.2 已鑒定的昆蟲化學(xué)感受蛋白20
• 1.2.3 昆蟲化學(xué)感受蛋白的分布20-21
• 1.2.4 昆蟲CSPs的功能21
• 1.3 嗅覺受體研究進(jìn)展21-22
• 1.4 研究思路及意義22-23
• 1.5 技術(shù)路線23-24
• 第二章 西花薊馬感器掃描電鏡觀察24-33
• 2.1 材料與方法24-25
• 2.1.1 供試?yán)ハx24
• 2.1.2 儀器24
• 2.1.3 試驗(yàn)方法24-25
• 2.2 結(jié)果與分析25-31
• 2.2.1 西花薊馬觸角基本形態(tài)特征25
• 2.2.2 西花薊馬觸角感器類型、特征及分布25-28
• 2.2.3 西花薊馬足感器類型、特征及分布28-31
• 2.2.4 西花薊馬復(fù)眼感器類型、特征及分布31
• 2.3 討論31-33
• 第三章 西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因分子克隆33-84
• 3.1 材料與方法33-46
• 3.1.1 供試?yán)ハx33
• 3.1.2 主要試劑33-34
• 3.1.3 儀器設(shè)備34
• 3.1.4 主要緩沖液和培養(yǎng)基的配方34-35
• 3.1.5 試驗(yàn)方法35-45
• 3.1.6 西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因的鑒定45
• 3.1.7 序列分析和進(jìn)化樹構(gòu)建45-46
• 3.2 結(jié)果與分析46-83
• 3.2.1 西花薊馬觸角總RNA提取46
• 3.2.2 西花薊馬嗅覺相關(guān)基因特異性片段擴(kuò)增46-48
• 3.2.3 西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因 3′-RACE48-49
• 3.2.4 西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因 5′-RACE49-51
• 3.2.5 目的基因全長cDNA序列的獲取51
• 3.2.6 西花薊馬FoccCSP1蛋白基因基本理化性質(zhì)51-56
• 3.2.7 西花薊馬FoccCSP2蛋白基本理化性質(zhì)56-63
• 3.2.8 西花薊馬FoccOBP1蛋白基本理化性質(zhì)63-71
• 3.2.9 西花薊馬FoccOBP2蛋白基本理化性質(zhì)71-74
• 3.2.10 西花薊馬FoccOR1蛋白基本理化性質(zhì)74-83
• 3.3 討論83-84
• 第四章 西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白基因表達(dá)譜分析84-95
• 4.1 材料和方法84-86
• 4.1.1 供試?yán)ハx84
• 4.1.2 試劑84
• 4.1.3 儀器設(shè)備84
• 4.1.4 RNA的提取84-85
• 4.1.5 第一鏈cDNA的合成85
• 4.1.6 Real-time qPCR85-86
• 4.2 結(jié)果與分析86-93
• 4.2.1 FoccCSP1表達(dá)譜分析86-88
• 4.2.2 FoccCSP2表達(dá)譜分析88-89
• 4.2.3 FoccOBP1表達(dá)譜分析89-90
• 4.2.4 FoccOBP2表達(dá)譜分析90-92
• 4.2.5 FoccOR1表達(dá)譜分析92-93
• 4.3 討論93-95
• 第五章 西花薊馬嗅覺相關(guān)蛋白的原核表達(dá)與純化95-118
• 5.1 材料與方法95-106
• 5.1.1 供試?yán)ハx95
• 5.1.2 主要試劑95
• 5.1.3 主要儀器設(shè)備95-96
• 5.1.4 聚丙烯酰胺凝膠及電泳緩沖液的配制96-98
• 5.1.5 試驗(yàn)方法98-106
• 5.2 結(jié)果與分析106-117
• 5.2.1 開放閱讀框擴(kuò)增106-107
• 5.2.2 重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建107-109
• 5.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定109-110
• 5.2.4 重組蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)110-112
• 5.2.5 重組蛋白western雜交112-113
• 5.2.6 分離重組蛋白113-115
• 5.2.7 純化重組蛋白115-116
• 5.2.8 目的蛋白濃度測定116-117
• 5.3 討論117-118
• 第六章 西花薊馬化學(xué)感受蛋白FOCCCSP2結(jié)合特性118-126
• 6.1 材料和方法118-120
• 6.1.1 試劑118
• 6.1.2 儀器118-120
• 6.2 結(jié)果與分析120-125
• 6.2.1 西花薊馬化學(xué)感受蛋白FoccCSP2與 1-NPN報(bào)告子的熒光光譜分析120-122
• 6.2.2 不同氣味物質(zhì)與 1-NPN和重組FoccCSP2蛋白的競爭結(jié)合分析122-125
• 6.3 討論125-126
• 第七章 西花薊馬化學(xué)感受蛋白FOCCCSP1免疫電鏡定位126-133
• 7.1 材料與方法126-128
• 7.1.1 試劑126
• 7.1.2 儀器126
• 7.1.3 緩沖液配方126-127
• 7.1.4 試驗(yàn)方法127-128
• 7.2 結(jié)果與分析128-132
• 7.2.1 抗體最佳稀釋濃度的確定128-130
• 7.2.2 西花薊馬化學(xué)感受蛋白FoccCSP1免疫定位130-132
• 7.3 討論132-133
• 第八章 全文結(jié)論133-135
• 參考文獻(xiàn)135-154
• 致謝154-155
• 作者簡歷155

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：987881