本文關鍵詞：唐古特白刺懸浮細胞體系的構建及耐鹽代謝機制研究

  更多相關文章： 唐古特白刺 懸浮細胞 耐鹽性 代謝組學 代謝機制 生理指標

【摘要】：唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)屬蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺屬(Nitraria L.)灌木,是我國特有白刺種之一,是典型的稀鹽型鹽生植物,具有較強的耐鹽和抗旱能力,是荒漠、半荒漠和鹽漬化土地上的重要建群種或優(yōu)勢種。因此,研究其耐鹽代謝機理對培育耐鹽新品種及發(fā)現(xiàn)耐鹽新途徑具有重要意義。本研究以唐古特白刺為材料,構建了穩(wěn)定、快速生長的懸浮細胞體系,研究了其生長特性,進而研究了鹽脅迫下細胞的生長速度、滲透調節(jié)物、膜損傷程度及抗氧化酶活性的變化情況;再利用代謝組學方法研究了不同鹽濃度脅迫下唐古特白刺懸浮細胞代謝譜的差異,篩選出細胞耐鹽標志性代謝物,并分析了代謝物對鹽脅迫的響應,通過構建細胞在鹽脅迫下的主要代謝途徑,分析了代謝物之間的代謝關聯(lián)性,探索了唐古特白刺細胞適應鹽脅迫的重要生理代謝調控機制。主要結果歸納如下:1.唐古特白刺的莖段誘導出愈傷組織的能力高于葉片。篩選出誘導愈傷組織和懸浮細胞繼代培養(yǎng)的最佳激素配比為2,4-D 1.5 mg?L-1、NAA 0.2 mg?L-1、6-BA 0.4 mg?L-1。細胞懸浮培養(yǎng)最佳接種方式為7.5 m L母液于含有30 m L MS液體培養(yǎng)基的100 m L錐形瓶中,搖床上黑暗培養(yǎng),轉速120 r?min-1,溫度26~28℃,繼代培養(yǎng)最佳時間為接種后的第9 d。在繼代培養(yǎng)的第3 d,細胞活力達到最高值,吸光度為0.69,細胞代謝最為旺盛;第7 d細胞分裂指數(shù)達到最高值,為5.1%,即分裂比較旺盛。細胞的存活率在細胞生長延遲期和穩(wěn)定期較對數(shù)期下降略快,但均保持在84%-93%之間。2.鹽脅迫對唐古特白刺懸浮細胞的生長影響明顯。低鹽濃度(100 mmol?L-1)促進細胞生長,細胞最快達到快速生長中期,能達到的生長極限值最大,為0.9379 mg?m L-1;高鹽濃度(≥150 mmol?L-1)抑制細胞生長,達到快速生長中期時間延后,生長極限值降低。從細胞生長的臨界濃度(C50)可知,唐古特白刺懸浮細胞耐鹽閾值高達227 mmol?L-1,表明其具有較強的耐鹽能力。3.鹽脅迫下唐古特白刺懸浮細胞可通過改變滲透調節(jié)物的含量和抗氧化酶的活性來適應鹽環(huán)境。在低鹽濃度下(100 mmol?L-1),可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸3種滲透調節(jié)物含量增加,隨培養(yǎng)時間的延長呈增加趨勢,而在高鹽濃度下(≥150 mmol?L-1),隨培養(yǎng)時間的延長呈先增加后降低的趨勢,且濃度越高達到最高值的時間越早,而可溶性糖表現(xiàn)更為突出。在100 mmol?L-1鹽處理下,MDA含量隨培養(yǎng)時間延長呈上升趨勢,而在150、200、250 mmol?L-1的鹽處理組中MDA含量隨培養(yǎng)時間延長呈先迅速增長而后趨于平衡的趨勢。與此同時,SOD和POD的活性和MDA含量變化基本一致,即抗氧化酶修復速度和細胞膜氧化速度變化一致。SOD活性到達最高值的時間較POD更早,是抗氧化調節(jié)的第一道防線。從各生理指標的相關性分析中可知,細胞鮮質量與可溶性糖和MDA的含量分別呈極顯著(P0.01)和顯著(P0.05)負相關,MDA含量和SOD、POD活性呈極顯著正相關(P0.01),可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量間呈極顯著正相關(P0.01),滲透調節(jié)物質含量和酶類活性之間呈極顯著正相關(P0.01)。表明唐古特白刺懸浮細胞通過增加可溶性糖來緩減滲透脅迫,以提高抗氧化酶活性來清除超氧自由基保護膜脂,且滲透調節(jié)和抗氧化調節(jié)同時進行并相互關聯(lián)。4.分析了鹽脅迫下唐古特白刺懸浮細胞的代謝譜變化。利用GC-TOF/MS從鹽脅迫處理下的唐古特白刺懸浮細胞水相和有機相代謝物提取液中分別檢測到373和629個物質峰,通過PLS-DA模型建立、統(tǒng)計分析和數(shù)據庫檢索,最終篩選并鑒定出25種具有潛在耐鹽標志性的代謝物,即:果糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖等糖類,脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸等氨基酸,蘋果酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、苯二甲酸、丁酸、壬二酸、丁二胺、乙酰胺、已二胺等有機酸和胺類,十八碳烯酸、十八烷酸、十六烷酸、亞麻酸、二十碳烷、十二烷等脂肪酸,以及植物甾醇谷甾醇。5.在分析唐古特白刺懸浮細胞響應鹽脅迫的主要代謝物組成和相對含量的基礎上,構建了其響應鹽脅迫的主要代謝途徑,包括糖類代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝、三羧酸循環(huán)等代謝途徑。其中鹽脅迫下糖類代謝活躍,葡萄糖、半乳糖、甘露糖含量呈增加趨勢,果糖和木糖含量呈降低趨勢;氨基酸代謝旺盛,鹽脅迫下其含量(脯氨酸、纈氨酸、丙氨酸)升高,脯氨酸含量尤為突出,在250 mmol?L-1處理下,細胞脯氨酸含量約是無鹽組的100倍;脂肪酸代謝速度加快,十六烷酸、十八烷酸、十八碳烯酸含量升高,在低鹽濃度下(100 mmol?L-1)即可達到最高值;有機酸類代謝比較穩(wěn)定,蘋果酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、苯二甲酸等的相對含量變化不大;谷甾醇含量增高。由此可知,唐古特白刺懸浮細胞通過對糖類、氨基酸、脂肪酸、有機酸、甾醇等物質的代謝調節(jié)協(xié)同增強了其抗鹽能力。綜上所述,本研究建立了唐古特白刺懸浮細胞懸浮培養(yǎng)體系,分析其鹽脅迫下的生長和生理指標,確定了細胞的耐鹽閾值;檢測并篩選出唐古特白刺懸浮細胞耐鹽標志性代謝物25種,并分析了其代謝調節(jié)方式,闡釋了唐古特白刺適應鹽脅迫代謝機制。相關研究結果將為白刺耐鹽機理的進一步研究及對耐鹽新品種的篩選、耐鹽新途徑的發(fā)現(xiàn)提供優(yōu)良材料和理倫依據。
【關鍵詞】：唐古特白刺 懸浮細胞 耐鹽性 代謝組學 代謝機制 生理指標
【學位授予單位】：中國林業(yè)科學研究院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S793.9
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-18
• 第一章 緒論18-37
• 1.1 引言18-19
• 1.1.1 研究背景18-19
• 1.1.2 研究目的和意義19
• 1.2 國內外研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢19-34
• 1.2.1 植物耐鹽生理機制的研究現(xiàn)狀19-22
• 1.2.2 代謝組學概述22-27
• 1.2.3 代謝組學在植物逆境脅迫研究中的應用27-32
• 1.2.4 唐古特白刺的研究現(xiàn)狀32-34
• 1.3 研究目標和主要研究內容34-36
• 1.3.1 關鍵的科學問題34
• 1.3.2 研究目標34
• 1.3.3 主要研究內容34-36
• 1.4 研究技術路線36-37
• 第二章 唐古特白刺懸浮細胞體系的建立及生長特性37-53
• 2.1 引言37-38
• 2.2 材料與方法38-42
• 2.2.1 試驗材料38
• 2.2.2 試驗方法38-40
• 2.2.3 測定指標與方法40-42
• 2.3 結果與分析42-50
• 2.3.1 莖段和葉片的表面滅菌效果42-43
• 2.3.2 不同外源激素對莖段和葉片愈傷組織誘導的影響43-45
• 2.3.3 唐古特白刺愈傷組織的形態(tài)分析45-46
• 2.3.4 唐古特白刺懸浮細胞培養(yǎng)中的的生長特性46-47
• 2.3.5 唐古特白刺懸浮細胞培養(yǎng)中接種量對細胞生長的影響47-48
• 2.3.6 唐古特白刺懸浮細胞培養(yǎng)中分裂指數(shù)的變化48-49
• 2.3.7 唐古特白刺懸浮細胞培養(yǎng)中細胞活力與存活率的變化49-50
• 2.4 討論50-52
• 2.4.1 唐古特白刺懸浮細胞體系的構建50-51
• 2.4.2 唐古特白刺懸浮細胞體系的生長特征51-52
• 2.5 小結52-53
• 第三章 鹽脅迫下唐古特白刺懸浮細胞的生長與生理特性53-75
• 3.1 引言53-54
• 3.2 材料與方法54-59
• 3.2.1 試驗材料54
• 3.2.2 試驗方法54
• 3.2.3 測定指標與方法54-59
• 3.2.4 數(shù)據處理及分析59
• 3.3 結果與分析59-70
• 3.3.1 不同鹽處理下唐古特白刺懸浮細胞的生長特征59-61
• 3.3.2 鹽脅迫下唐古特白刺懸浮細胞的耐鹽閾值61-62
• 3.3.3 不同鹽處理對唐古特白刺懸浮細胞有機滲透物質的影響62-65
• 3.3.4 不同鹽處理對唐古特白刺懸浮細胞抗氧化酶活性的影響65-67
• 3.3.5 不同鹽處理對唐古特白刺懸浮細胞膜損傷的影響67-68
• 3.3.6 唐古特白刺懸浮細胞鹽脅迫下各指標間的相關分析68-70
• 3.4 討論70-73
• 3.4.1 鹽脅迫對唐古特白刺懸浮細胞生長的影響70
• 3.4.2 唐古特白刺懸浮細胞的耐鹽閾值70
• 3.4.3 鹽脅迫對唐古特白刺懸浮細胞生理生化的影響70-73
• 3.5 小結73-75
• 第四章 鹽脅迫下唐古特白刺懸浮細胞的代謝組學分析75-105
• 4.1 引言75-76
• 4.2 材料與方法76-78
• 4.2.1 試驗材料76
• 4.2.2 試驗方法76
• 4.2.3 測定指標與方法76-78
• 4.2.4 數(shù)據處理及分析78
• 4.3 結果與分析78-99
• 4.3.1 細胞相對生物量、形態(tài)、滲透勢的影響78-81
• 4.3.2 鹽脅迫下唐古特白刺懸浮細胞代謝物的代謝譜分析81-83
• 4.3.3 鹽脅迫下唐古特白刺懸浮細胞標志代謝物及其相關分析83-99
• 4.4 討論99-103
• 4.4.1 鹽脅迫對細胞生物量、形態(tài)和滲透勢的影響99
• 4.4.2 鹽脅迫對細胞代謝譜的影響99-100
• 4.4.3 鹽脅迫對細胞糖類代謝途徑的影響100-101
• 4.4.4 鹽脅迫對細胞氨基酸類代謝途徑的影響101-102
• 4.4.5 鹽脅迫對細胞脂肪酸類代謝途徑的影響102
• 4.4.6 鹽脅迫對其他代謝途徑的影響102-103
• 4.5 小結103-105
• 第五章 結論與討論105-111
• 5.1 主要研究結論105-108
• 5.1.1 唐古特白刺懸浮細胞體系的建立及生長特性105-106
• 5.1.2 鹽脅迫下唐古特白刺懸浮細胞的生長與生理響應106-107
• 5.1.3 鹽脅迫下唐古特白刺懸浮細胞代謝組的變化107-108
• 5.2 討論108-110
• 5.3 展望110-111
• 參考文獻111-126
• 附錄126-127
• 在讀期間的學術研究127-128
• 致謝128

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前2條

1 曾玲玲;季生棟;王俊強;張成亮;趙剛;;植物耐鹽機理的研究進展[J];黑龍江農業(yè)科學;2009年05期

2 馬煥成,王沙生;胡楊膜系統(tǒng)的鹽穩(wěn)定性及鹽脅迫下的代謝調節(jié)[J];西南林學院學報;1998年01期

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本文編號：988205