發(fā)布時間：2017-10-07 00:00

  本文關(guān)鍵詞：馬鈴薯干旱相關(guān)microRNA的鑒定及功能研究

  更多相關(guān)文章： 馬鈴薯 MicroRNA 干旱脅迫 高通量測序 差異性分析

【摘要】：馬鈴薯是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大主糧作物。它兼具蔬菜、糧食、飼料以及工業(yè)加工原料等多種用途,在滿足人民生活和經(jīng)濟發(fā)展方面起著至關(guān)重要的作用。然而干旱脅迫嚴重影響其生長發(fā)育品質(zhì)以及產(chǎn)量,是限制馬鈴薯生產(chǎn)最主要的非生物脅迫因素之一。植物對干旱脅迫的響應(yīng)主要是通過調(diào)控相關(guān)基因的表達產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)來實現(xiàn)。到目前為止,大量干旱相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平已被鑒定出來。但對其轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控研究的報道較少。MicroRNAs是一類重要的非編碼單鏈小分子RNA,通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達。研究發(fā)現(xiàn),其調(diào)控的靶基因參與植物的生長發(fā)育和對各種非生物脅迫的響應(yīng),并且越來越多的miRNA功能相繼被鑒定出來。但這些研究主要集中在擬南芥、水稻等模式植物中,對馬鈴薯干旱相關(guān)miRNA及其靶基因的研究報道較少。本研究利用序列同源比對以及miRNA二級結(jié)構(gòu)分析,在馬鈴薯中鑒定出3個miR159和4個miR169家族新成員以及馬鈴薯中可能參與調(diào)控干旱脅迫下脯氨酸積累代謝的miRNAs。并且通過構(gòu)建馬鈴薯耐旱型品種紫花白和干旱敏感型品種大西洋干旱處理和對照4個樣品小RNA文庫并測序,獲得了大量旱相關(guān)的miRNAs。通過構(gòu)建了馬鈴薯混合降解組文庫并測序,以及降解位點進行了分析,驗證了部分miRNA的靶基因,并對部分干旱相關(guān)重要靶基因的切割位點進行了5'-RLM-RACE驗證。本研究獲得的主要結(jié)果如下:1.基于植物miR159/169家族成員分別調(diào)控MYB和NF-YA類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控模式的保守性。本研究通過生物信息學(xué)分析在馬鈴薯中預(yù)測出3個miR159家族成員和4個miR169家族新成員。并通過靶基因預(yù)測,發(fā)現(xiàn)miR159可能調(diào)控R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員,miR169可能調(diào)控NF-YA轉(zhuǎn)錄因子家族成員。并通過對miR159/169s和其預(yù)測靶基因的表達分析,發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下miR159/169s與其靶基因的表達模式呈負相關(guān)。因此,我們推斷在干旱脅迫下,miR159/MYB和miR169/NF-YA的調(diào)控模式在馬鈴薯中也保守。2.為了研究miRNA是否參與干旱脅迫下脯氨酸積累代謝的調(diào)控。本研究以脯氨酸代謝相關(guān)酶基因mRNA序列作為潛在的miRNA靶基因序列與miRBase中已知植物的miRNA進行比對,并獲得大量候選mi RNAs,經(jīng)過一系列的篩選和生物信息學(xué)分析,共獲得6個miRNA家族的11個miRNAs可能與馬鈴薯干旱脅迫下脯氨酸積累代謝的調(diào)控有關(guān)。結(jié)合定量PCR檢測和調(diào)控機理分析,最終獲得6個miRNA可能參與馬鈴薯干旱脅迫下脯氨酸積累代謝的調(diào)控。分別為miR172miR396cmiR396a和miR4233可能調(diào)節(jié)脯氨酸代謝酶P5CS基因,miR2673可能調(diào)節(jié)脯氨酸代謝酶P5CR基因,miR6461可能調(diào)節(jié)脯氨酸代謝酶ProDH基因。這一研究結(jié)果可以幫助我們很好的了解干旱脅迫下miRNA參與調(diào)控脯氨酸積累代謝的分子機理。3.為了在馬鈴薯全基因組水平篩選干旱相關(guān)的miRNAs,本研究通過構(gòu)建馬鈴薯耐旱型品種紫花白和干旱敏感型品種大西洋干旱處理和對照4個樣品小RNA文庫并進行sRNA高通量測序。通過將測序結(jié)果與miRNAbase比對以及一系列生物信息學(xué)分析。最終在4個樣本中共鑒定出1,338個miRNA,其中59為馬鈴薯已知的miRNA,1,279個為馬鈴薯新預(yù)測的miRNA;并對這些miRNA進行干旱脅迫下差異表達分析,結(jié)果表明在馬鈴薯干旱敏感型品種大西洋中有318個miRNA在干旱處理前后差異表達,在馬鈴薯耐旱型品種紫花白中有89個miRNA在干旱處理前后差異表達,并通過靶基因預(yù)測獲得大量差異表達mi RNA的靶基因。4.miRNA功能研究的關(guān)鍵是鑒定其調(diào)控的靶基因。本研究為了更好的闡述差異表達miRNA參與干旱脅迫調(diào)控的分子機理,通過構(gòu)建馬鈴薯混合降解組文庫并測序,在馬鈴薯中共檢測到84個靶基因的90個降解位點發(fā)生降解。通過對靶基因的功能注釋,最終鑒定出12個mi RNA靶基因與干旱相關(guān),其中7個mi RNA靶基因獲得了5'-RLM-RACE驗證。這些靶基因包括一些干旱相關(guān)的功能蛋白(抗壞血酸過氧化物酶,谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和泛素結(jié)合酶),信號傳導(dǎo)的激酶(絲氨酸/蘇氨酸激酶)和轉(zhuǎn)錄因子(HD-Zip類轉(zhuǎn)錄因子,SPL類轉(zhuǎn)錄因子,NAC類轉(zhuǎn)錄因子和鋅指結(jié)構(gòu)類轉(zhuǎn)錄因子)。熒光定量PCR表達分析表明,這些miRNA的表達量在馬鈴薯耐旱型品種紫花白或干旱敏感型品種大西洋干旱處理前后存在明顯的差異。以上結(jié)果表明:miRNA在馬鈴薯干旱脅迫的響應(yīng)過程中起著重要的調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：馬鈴薯 MicroRNA 干旱脅迫 高通量測序 差異性分析
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S532
【目錄】：

• 摘要2-4
• SUMMARY4-6
• 縮略語表6-12
• 第一章 文獻綜述12-30
• 1.1 植物抗旱性機制概述12-18
• 1.1.1 植物抗旱的生理機制12-13
• 1.1.2 植物抗旱的分子機理13-17
• 1.1.2.1 功能基因14-16
• 1.1.2.1.1 滲透調(diào)節(jié)劑生物合成基因14-15
• 1.1.2.1.2 細胞抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因15-16
• 1.1.2.1.3 植物水通道蛋白基因16
• 1.1.2.1.4 蛋白酶類基因16
• 1.1.2.2 調(diào)節(jié)基因16-17
• 1.1.2.2.1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因16-17
• 1.1.2.2.2 轉(zhuǎn)錄因子類基因17
• 1.1.3 馬鈴薯的抗旱性研究17-18
• 1.2 MIRNA的概況和研究進展18-28
• 1.2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)18
• 1.2.2 植物miRNA的生物合成及作用方式18-19
• 1.2.3 植物miRNA的分離鑒定19-20
• 1.2.3.1 直接克隆分離法19
• 1.2.3.2 正向遺傳學(xué)鑒定法19-20
• 1.2.3.3 生物信息學(xué)的方法鑒定20
• 1.2.3.4 基因芯片鑒定法20
• 1.2.4 miRNA與植物的生長發(fā)育20-22
• 1.2.4.1 miRNA參與調(diào)控植物開花及花器官發(fā)育20-21
• 1.2.4.2 miRNA參與調(diào)控植物葉片發(fā)育21
• 1.2.4.3 miRNA參與調(diào)控植物器官形變21-22
• 1.2.4.4 miRNA參與調(diào)控植物激素信號的傳導(dǎo)22
• 1.2.5 miRNA參與自身的反饋調(diào)節(jié)22-23
• 1.2.6 miRNA與植物的養(yǎng)分脅迫23-25
• 1.2.6.1 miRNA與低磷脅迫23-24
• 1.2.6.2 miRNA與氮脅迫24
• 1.2.6.3 miRNA與硫脅迫24-25
• 1.2.6.4 miRNA與微量元素脅迫25
• 1.2.7 miRNA與植物的氧化脅迫25-26
• 1.2.8 miRNA與植物的低溫脅迫26
• 1.2.9 miRNA與植物的鹽脅迫26-27
• 1.2.10 miRNA與植物干旱脅迫27-28
• 1.3 本研究的目的和意義28-30
• 第二章 馬鈴薯MIR159/169及其靶基因的預(yù)測及表達分析30-52
• 2.1 實驗材料30-31
• 2.1.1 植物材料30
• 2.1.2 數(shù)據(jù)來源30-31
• 2.1.3 分析軟件31
• 2.2 實驗方法31-37
• 2.2.1 馬鈴薯miR159/169的預(yù)測31-32
• 2.2.2 實驗材料的生長及干旱處理32
• 2.2.3 RNA的提取及檢測32-33
• 2.2.4 Stu-miR159/169s靶基因的預(yù)測及功能分析33-34
• 2.2.5 靶基因序列的生物信息學(xué)分析34
• 2.2.6 Stu-miR159/169s成熟序列的qRT-PCR表達分析34-36
• 2.2.7 預(yù)測靶基因的熒光定量PCR驗證36-37
• 2.3 實驗結(jié)果37-48
• 2.3.1 馬鈴薯中miR159/169家族成員的預(yù)測37-40
• 2.3.2 miR159/169靶基因的鑒定及克隆40-43
• 2.3.3 靶基因的進化樹分析43-46
• 2.3.4 靶基因的基因結(jié)構(gòu)分析46
• 2.3.5 miR159/169通過調(diào)控MYB和NF-YA轉(zhuǎn)錄因子來響應(yīng)干旱脅迫46-48
• 2.4 討論48-52
• 2.4.1 miR159/169在馬鈴薯中也保守存在49-50
• 2.4.2 馬鈴薯miR159/169通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MYB和NF-YA來響應(yīng)干旱脅迫50-52
• 第三章 馬鈴薯干旱脅迫下脯氨酸代謝相關(guān)MIRNAS的鑒定52-63
• 3.1 實驗材料52-53
• 3.1.1 植物材料52
• 3.1.2 數(shù)據(jù)來源52-53
• 3.2 實驗方法53-55
• 3.2.1 實驗流程圖53
• 3.2.2 材料處理53-54
• 3.2.3 脯氨酸含量的測定54
• 3.2.4 以P5CS, P5CR和ProDH基因mRNA序列預(yù)測miRNA54
• 3.2.5 保守miRNAs在馬鈴薯中的計算機預(yù)測54
• 3.2.6 獲得miRNAs的表達分析54-55
• 3.3 實驗結(jié)果55-60
• 3.3.1 干旱脅迫下脯氨酸含量的變化55
• 3.3.2 預(yù)測可能調(diào)控脯氨酸代謝的miRNAs55-59
• 3.3.3 QRT-PCR表達分析篩選調(diào)控馬鈴薯脯氨酸代謝相關(guān)的miRNAs59-60
• 3.4 討論60-63
• 3.4.1 馬鈴薯不同品種抗旱性與脯氨酸積累的關(guān)系60-61
• 3.4.2 MiRNA可能參與干旱脅迫下脯氨酸的積累的調(diào)控61-63
• 第四章馬鈴薯不同耐旱型品種干旱相關(guān)的miRNAs的鑒定63-95
• 4.1 實驗材料63-64
• 4.1.1 植物材料63
• 4.1.2 數(shù)據(jù)庫及軟件63
• 4.1.3 主要儀器63-64
• 4.2 實驗方法64-69
• 4.2.1 材料處理64
• 4.2.2 RNA的提取及檢測64-65
• 4.2.3 小RNA文庫的構(gòu)建及測序65-66
• 4.2.4 測序數(shù)據(jù)的基本分析66-67
• 4.2.5 miRNA的鑒定67-68
• 4.2.5.1 長度的分類統(tǒng)計67
• 4.2.5.2 堿基偏向性分析67
• 4.2.5.3 已知的miRNAs的鑒定67
• 4.2.5.4 新miRNA的預(yù)測67-68
• 4.2.6 miRNA的差異分析68
• 4.2.7 miRNA靶基因的預(yù)測68-69
• 4.2.8 預(yù)測靶基因的功能注釋69
• 4.3 結(jié)果與分析69-93
• 4.3.1 測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析69
• 4.3.2 sRNA的Rfam注釋69-71
• 4.3.3 樣品間small RNA公共及特有序列分析71-74
• 4.3.4 sRNA長度統(tǒng)計74-79
• 4.3.5 miRNA成熟序列的堿基偏好性分析79-80
• 4.3.6 已知miRNA的鑒定80-81
• 4.3.7 四個樣品中新預(yù)測的miRNAs81-84
• 4.3.8 miRNA靶基因的預(yù)測84-85
• 4.3.9 miRNA的差異表達分析85-90
• 4.3.9.1 差異表達miRNA的維恩圖86
• 4.3.9.2 差異表達miRNA的聚類分析86-90
• 4.3.10靶基因的功能注釋90-93
• 4.3.10.1 所有靶基因的注釋90
• 4.3.10.2 差異表達miRNA靶基因的注釋90
• 4.3.10.3 差異表達miRNA靶基因的GO分類90-91
• 4.3.10.4 差異miRNA靶基因的COG注釋91-92
• 4.3.10.5 差異miRNA靶基因的KEGG通路富集分析92-93
• 4.4 討論93-95
• 4.4.1 sRNA高通量測序?qū)悠稲NA質(zhì)量的要求93-94
• 4.4.2 高通量測序?qū)π耺iRNA的鑒定及差異表達miRNA篩選的有效性94-95
• 第五章 馬鈴薯miRNA的靶基因的鑒定95-120
• 5.1 實驗材料95-96
• 5.1.1 植物材料95
• 5.1.2 軟件及數(shù)據(jù)庫95-96
• 5.2 實驗方法96-101
• 5.2.0 材料處理96
• 5.2.1 RNA 的提取及檢測96
• 5.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建及測序96-97
• 5.2.3 降解組測序數(shù)據(jù)的分析97
• 5.2.4 馬鈴薯干旱相關(guān)miRNA及其靶基因的鑒定97
• 5.2.5 干旱相關(guān)miRNA靶基因的RLM-5'RACE驗證97-100
• 5.2.5.1 5'端接頭的連接97-98
• 5.2.5.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈98
• 5.2.5.3 巢式PCR反應(yīng)擴增98-100
• 5.2.5.4 目的片段與T載體的連接100
• 5.2.5.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及測序100
• 5.2.6 干旱相關(guān)miRNA的qRT-PCR驗證100-101
• 5.3 結(jié)果與分析101-113
• 5.3.1 基礎(chǔ)分析101-103
• 5.3.1.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計101-102
• 5.3.1.2 非編碼RNA注釋102-103
• 5.3.2 降解位點分析103-106
• 5.3.3 馬鈴薯干旱相關(guān)miRNA靶基因的 5’RACE驗證106-110
• 5.3.4 馬鈴薯干旱相關(guān)miRNA的熒光定量分析110-113
• 5.4 討論113-120
• 5.4.1 降解組測序鑒定馬鈴薯miRNA靶基因的有效性113-114
• 5.4.2 MiRNA參與調(diào)控馬鈴薯對干旱脅迫的響應(yīng)114-119
• 5.4.3 后期的實驗安排119-120
• 結(jié)論120-121
• 參考文獻121-138
• 致謝138-139
• 作者簡介139-140
• 導(dǎo)師簡介140-141
• 附錄141-204

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 曹雪;上官凌飛;于華平;楊光;王晨;譚洪花;房經(jīng)貴;;葡萄SBP基因家族生物信息學(xué)分析[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2010年04期

2 戴高興;彭克勤;蕭浪濤;鄧國富;;聚乙二醇模擬干旱對耐低鉀水稻幼苗丙二醛、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性的影響[J];中國水稻科學(xué);2006年05期

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本文編號：985729