本文關(guān)鍵詞：芽胞桿菌生物膜形成機(jī)制研究

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【摘要】：芽胞桿菌是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一類重要的根際促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, PGPR),可定殖于植物根部發(fā)揮生防功能,但其具體生防機(jī)理尚未清晰。已有研究證明很多芽胞桿菌“應(yīng)答”外界環(huán)境信號形成生物膜,穩(wěn)定定殖于植物根部。研究芽胞桿菌生物膜形成機(jī)制及調(diào)控途徑,不僅有利于揭示其定殖及生防機(jī)理,而且為生物農(nóng)藥的研發(fā)提供理論指導(dǎo),推動芽胞桿菌的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。本研究以兩株生防菌蠟樣芽胞桿菌905 (Bacillus cereus 905)和枯草芽胞桿菌NCIB 3610 (B. subtilis NCIB 3610)為研究對象,借助分子生物學(xué)技術(shù),結(jié)合全基因組序列,系統(tǒng)研究了生物膜形成機(jī)制。本研究首次報道了蠟樣芽胞桿菌在不同的培養(yǎng)基中利用不同的機(jī)制形成兩種不同形式的生物膜；外界環(huán)境信號影響枯草芽胞桿菌中酪氨酸激酶／酪氨酸激酶調(diào)節(jié)器(EpsB/EpsA和PtkA/TkmA)之間的“交互應(yīng)答”,在翻譯后水平上調(diào)控EPS的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控生物膜的形成。主要研究結(jié)果如下：(1)本研究通過對培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化,證明了B. cereus 905可以在MSgg培養(yǎng)基空氣-液體交界面形成薄皮型生物膜(pellicles),在TSBG培養(yǎng)基底部形成潛底型生物膜(submerged biofilms)。通過與枯草芽胞桿菌中生物膜基因進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對,鑒定了B. cereus 905基因組中含有生物膜基因的同源序列。通過B. cereus 905相關(guān)基因缺失突變體的構(gòu)建,生物膜表型檢測發(fā)現(xiàn)了：spo0A、sinI、sipW和calY基因參與薄皮型生物膜的形成,推測B. cereus905在MSgg培養(yǎng)基中形成薄皮型生物膜的機(jī)制可能和B. subtilis的相似；但是這些基因均不參與潛底型生物膜的形成,而弱酸性環(huán)境(pH≤6.5)是其形成的必需條件,推測B. cereus 905在TSBG培養(yǎng)基底部形成潛底型生物膜的機(jī)制可能和金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的相似。此外,我們還鑒定了B. cereus 905生物膜基質(zhì)主要包含蛋白質(zhì)和胞外DNA。蠟樣芽胞桿菌在生物膜形成過程中并不誘導(dǎo)eps的表達(dá),表明生物膜的形成不需要胞外多糖的參與.(2)已有研究證明酪氨酸激酶參與枯草芽胞桿菌生物膜的形成。B. subtilis NCIB 3610基因組中包含兩組酪氨酸激酶／酪氨酸激酶調(diào)節(jié)器：EpsB/EpsA和PtkA/TkmA。本研究表明它們之間可以“交互應(yīng)答”：TkmA不僅可以激活同源的PtkA,還可以激活非同源的EpsB。通過對缺失突變體表型檢測證明了,在LBGM培養(yǎng)基中,tkmA缺失突變體(△tkmA)不能形成生物膜；然而在MSgg培養(yǎng)基中,△tkmA盡管造成了生物膜形態(tài)的改變,卻不能抑制生物膜的形成,這表明了TkmA對于生物膜形成的重要性是營養(yǎng)依賴性的。在△tkmA中誘導(dǎo)EpsAB過量表達(dá)可以回補生物膜的形成,由此推測TkmA是通過調(diào)控EpsB影響生物膜的形成。基于AtkmA-ugd抑制突變子序列分析,通過測定lacZ報告菌株的活性證明SpoOA和DegU共同調(diào)控tkmA-ugd和epsA-O操縱子：在LBGM培養(yǎng)基中高活性的SpoOA和DegU促進(jìn)TkmA的表達(dá)量升高,TkmA對于生物膜的形成發(fā)揮重要作用；在MSgg培養(yǎng)基中低活性的SpoOA和DegU促進(jìn)EpsA的表達(dá)量升高,EpsA對于生物膜的形成表現(xiàn)出更為重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：芽胞桿菌 生物膜 tkmA pH 作用機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S476.1
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 縮略語表8-16
• 第一章 緒論16-56
• 1.1 細(xì)菌與生物膜概述16-17
• 1.1.1 細(xì)菌概念16
• 1.1.2 芽胞桿菌形態(tài)學(xué)特征16
• 1.1.3 生物膜概念16-17
• 1.2 細(xì)菌生物膜的形成、組成成分及生物學(xué)意義17-26
• 1.2.1 細(xì)菌生物膜形成條件17-21
• 1.2.2 與植物相關(guān)的生物膜21-23
• 1.2.3 細(xì)菌生物膜的組成結(jié)構(gòu)23-25
• 1.2.4 細(xì)菌生物膜的作用25-26
• 1.3 細(xì)菌生物膜的生活史26-28
• 1.4 蠟樣芽胞桿菌生物膜研究進(jìn)展28-37
• 1.4.1 蠟樣芽胞桿菌生物膜的形成方式及組成成分28-32
• 1.4.2 蠟樣芽胞桿菌生物膜形成過程中的基因調(diào)控途徑32-36
• 1.4.3 蠟樣芽胞桿菌生物膜與生防的關(guān)系36-37
• 1.5 枯草芽胞桿菌生物膜研究進(jìn)展37-52
• 1.5.1 枯草芽胞桿菌生物膜形成方式37-38
• 1.5.2 枯草芽胞桿菌生物膜基質(zhì)組成成分38-42
• 1.5.3 枯草芽胞桿菌生物膜形成過程中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)42-49
• 1.5.4 枯草芽胞桿菌生物膜的發(fā)展及消解49-50
• 1.5.5 生物膜在生防枯草芽胞桿菌生防中發(fā)揮的重要功能50-52
• 1.6 研究內(nèi)容及目的意義52-56
• 1.6.1 研究內(nèi)容52-53
• 1.6.2 研究目的與意義53-56
• 第二章 蠟樣芽胞桿菌生物膜形成機(jī)制研究56-91
• 2.1 實驗材料56-66
• 2.1.1 細(xì)菌菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件56-59
• 2.1.2 酶和引物合成59-61
• 2.1.3 培養(yǎng)基及實驗溶液配制61-65
• 2.1.4 主要實驗儀器65-66
• 2.2 實驗方法66-77
• 2.2.1 生物信息學(xué)分析66
• 2.2.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備66
• 2.2.3 B.cereus 905菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備及電擊轉(zhuǎn)化66-67
• 2.2.4 B.cereus菌株基因組DNA的提取67-68
• 2.2.5 質(zhì)粒DNA的小量提取68
• 2.2.6 缺失突變重組質(zhì)粒的構(gòu)建68-72
• 2.2.7 目標(biāo)基因缺失突變體的構(gòu)建及篩選72-74
• 2.2.8 功能互補載體的構(gòu)建74-75
• 2.2.9 蠟樣芽胞桿菌形成潛底型生物膜的定量分析75
• 2.2.10 蠟樣芽胞桿菌形成潛底型生物膜的定性分析75
• 2.2.11 蠟樣芽胞桿菌在MSgg中形成薄皮型生物膜的分析75-76
• 2.2.12 蠟樣芽胞桿菌生物膜形成中pH的測定76
• 2.2.13 蠟樣芽胞桿菌生物膜對Proteinase K和DNase I敏感性的測定76
• 2.2.14 蠟樣芽胞桿菌芽孢的形成76-77
• 2.2.15 蠟樣芽胞桿菌玻片的制備77
• 2.3 結(jié)果與分析77-88
• 2.3.1 B.cereus 905基因組中含有相關(guān)的生物膜基因77-81
• 2.3.2 B.cereus 905可以在MSgg中形成薄皮型生物膜81-83
• 2.3.3 促進(jìn)905形成潛底型生物膜條件的篩選83-84
• 2.3.4 弱酸性條件是905形成潛底型生物膜的必需條件84-86
• 2.3.5 胞外DNA和蛋白是905生物膜的主要組成成分86-88
• 2.4 小結(jié)88
• 2.5 討論88-91
• 第三章 枯草芽胞桿菌酪氨酸激酶調(diào)節(jié)器TkmA在生物膜形成過程中的功能研究91-131
• 3.1 實驗材料91-98
• 3.1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件91-95
• 3.1.2 酶和引物合成95-96
• 3.1.3 培養(yǎng)基與實驗溶液配制96-98
• 3.2 實驗方法98-112
• 3.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化98
• 3.2.2 B.subtilis菌株基因組DNA的提取98-99
• 3.2.3 質(zhì)粒DNA的小量提取99
• 3.2.4 枯草芽胞桿菌基因缺失突變體的構(gòu)建99-103
• 3.2.5 枯草芽胞桿菌ΔtkmA突變體功能互補菌株的構(gòu)建103
• 3.2.6 枯草芽胞桿菌ΔtkmA突變體epsA互補菌株的構(gòu)建103-104
• 3.2.7 枯草芽胞桿菌ΔtkmA突變體點突變互補菌株的構(gòu)建104-105
• 3.2.8 點突變菌株YC997,YC999,TG043,YC998,YC1200和TG044的構(gòu)建105-107
• 3.2.9 組成型表達(dá)LacZ菌株的構(gòu)建107-110
• 3.2.10 EpsAB過量表達(dá)菌株的構(gòu)建110-111
• 3.2.11 抑制突變體YC820突變序列的確定111
• 3.2.12 β-半乳糖苷酶活性的測定111-112
• 3.2.13 枯草芽胞桿菌生物膜評價112
• 3.3 結(jié)果與分析112-127
• 3.3.1 tkmA-ugd操縱子調(diào)控區(qū)序列分析112-114
• 3.3.2 tkmA缺失突變體在LBGM培養(yǎng)基中形成生物膜的能力顯著降低114-115
• 3.3.3 TkmA結(jié)構(gòu)域的定點突變分析115-117
• 3.3.4 ΔtkmA-ugd的抑制突變體生物膜檢測及序列分析117-119
• 3.3.5 單核苷酸突變降低sinR的表達(dá)量,顯著地提高epsA-O的表達(dá)量119-120
• 3.3.6 過量表達(dá)EpsAB可以回補AtkmA或ΔtkmA-ugd造成的生物膜形成缺陷120-122
• 3.3.7 SpoOA和DegU對tkmA-ugd和epsA-O操縱子的復(fù)雜性調(diào)控122-125
• 3.3.8 tkmA在LBGM中的表達(dá)量高于在MSgg中的表達(dá)量,而epsA正好相反125-126
• 3.3.9 在LBGM和MSgg中DegU和Spo0A調(diào)節(jié)tkmA和epsA的表達(dá)量126-127
• 3.4 小結(jié)127-128
• 3.5 討論128-131
• 第四章 結(jié)論與展望131-134
• 4.1 結(jié)論131-132
• 4.1.1 生物膜形成類型的多樣性研究131
• 4.1.2 營養(yǎng)影響生物膜形成的研究131
• 4.1.3 蠟樣芽胞桿菌生物膜形成機(jī)制研究131-132
• 4.2 本研究的創(chuàng)新性132
• 4.2.1 蠟樣芽胞桿菌利用兩種獨立的機(jī)制形成生物膜132
• 4.2.2 TkmA在枯草芽胞桿菌生物膜產(chǎn)生過程中表現(xiàn)出新功能132
• 4.3 展望132-134
• 參考文獻(xiàn)134-146
• 附錄146-204
• 附錄1——GenBank收錄的Bacillus cereus 905的序列146-190
• 附錄2——GenBank收錄的Bacillus subtilis NCIB 3610的序列190-204
• 致謝204-206
• 作者簡歷206-208

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本文編號：804630