發(fā)布時間：2017-09-06 15:38

  本文關鍵詞：保護斑馬魚（Danio rerio）胚胎免受細菌感染的新型母源性LPS結合蛋白ZRANB2的鑒定

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【摘要】：斑馬魚是研究母源性免疫的重要模式生物,已經逐漸成為人們進行免疫學研究的新寵。本文采用高通量分離的方法從斑馬魚胚胎提取液中分離得到一個LPS結合蛋白-ZRANB2。ZRANB2普遍存在于各種生物體中,但是其功能和作用機制所知甚少。本文對ZRANB2進行了生物信息學分析、表達模式分析、體內體外抗菌活性研究以及抗菌活性中心的探尋,初步證明ZRANB2是一個母源性免疫因子。首先,本文分別在分子水平和蛋白水平,證明ZRANB2在斑馬魚各組織中都有表達,卵巢中表達量最高,在胚胎發(fā)育早期ZRANB2也大量存在,這說明其確實為一母源性蛋白。其次,通過序列比對發(fā)現(xiàn),斑馬魚ZRANB2與哺乳動物、鳥類、兩棲類和硬骨魚的ZRANB2的一致性在氨基酸水平達到79.2%,80.3%,80.6%和82.3%,這說明ZRANB2的序列比較保守。經三維結構預測得知,斑馬魚ZRANB2與人ZRANB2結構相似,都主要由β折疊片層組成。再次,體外功能驗證證明重組ZRANB2 (rZRANB2)作為模式識別受體可以識別細菌信號分子LPS,能與革蘭氏陰性菌大腸桿菌、鰻弧球菌和嗜水氣單胞菌結合,可以作為抗菌效應分子來直接殺死細菌。還對其體內活性進行了驗證,將rZRANB2用顯微注射技術注入斑馬魚早期胚胎可以顯著提高胚胎對斑馬魚病原菌嗜水氣單胞菌的抵抗能力,同時注入抗ZRANB2的抗體會讓抵抗力明顯地降低,而注入抗actin的抗體卻沒有此作用。最后,證明了Z1/37和Z11/37具有體外抗菌活性,將其注入胚胎也會提高胚胎對嗜水氣單胞菌的抵抗力,但是多肽Z38/198卻沒有相應的抗菌活性。綜上所述,本文闡明了ZRANB2是一個母源性LPS結合蛋白,可以通過結合和殺死細菌來保護斑馬魚早期胚胎抵御病原菌的侵襲,這是關于ZRANB2功能的一個新發(fā)現(xiàn)。本文為研究動物中普遍存在的鋅指蛋白的免疫功能提供了新的視角。
【關鍵詞】：斑馬魚 胚胎 ZRANB2 母源性 LPS結合蛋白
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 第一章 文獻綜述13-33
• 1 斑馬魚簡介13-15
• 2 魚類的免疫系統(tǒng)15-23
• 2.1 免疫系統(tǒng)的個體發(fā)生15-16
• 2.2 淋巴器官16-17
• 2.2.1 胸腺16
• 2.2.2 腎臟16-17
• 2.2.3 脾17
• 2.3 參與免疫反應的細胞17
• 2.4 魚類的非特異性免疫17-22
• 2.4.1 物理屏障17-18
• 2.4.2 非特異性細胞的細胞毒性18
• 2.4.3 抗菌肽18
• 2.4.4 吞噬作用18
• 2.4.5 補體18-19
• 2.4.6 腫瘤壞死因子(TNF)19
• 2.4.7 干擾素(INF)19-20
• 2.4.8 白介素(IL)20
• 2.4.9 其它的細胞因子和趨化因子20
• 2.4.10 蛋白激酶抑制劑20
• 2.4.11 溶菌酶20-21
• 2.4.12 天然抗體21
• 2.4.13 正五聚蛋白21
• 2.4.14 轉鐵蛋白21-22
• 2.5 魚類的特異性免疫22-23
• 2.5.1 抗體22
• 2.5.2 免疫記憶22-23
• 2.5.3 細胞的細胞毒性23
• 2.5.4 適應性免疫中的細胞因子23
• 3 先天性免疫23-29
• 3.1 先天性免疫系統(tǒng)的非自我識別23-26
• 3.2 先天性免疫與疾病26-28
• 3.3 母源性免疫與魚類28-29
• 4 高通量分離技術29-30
• 5 鋅指蛋白研究概況30-31
• 5.1 鋅指結構30-31
• 5.2 鋅指蛋白31
• 6 ZRANB2的研究概況31-32
• 7 本文的研究目的和技術路線32-33
• 7.1 研究目的32
• 7.2 技術路線32-33
• 第二章 斑馬魚母源性免疫因子的高通量分離與鑒定33-95
• 1 前言33
• 2 材料和方法33-63
• 2.1 實驗材料33-36
• 2.1.1 實驗動物33
• 2.1.2 實驗儀器33-34
• 2.1.3 實驗試劑34-36
• 2.2 從斑馬魚胚胎提取液中高通量分離母源性免疫因子36-40
• 2.2.1 斑馬魚卵液的制備36-37
• 2.2.2 制備交聯(lián)有LPS的瓊脂糖凝膠柱37
• 2.2.3 上樣與洗脫37-38
• 2.2.4 SDS-PAGE檢測38-39
• 2.2.5 質譜鑒定39-40
• 2.3 Western blotting檢測目的蛋白在不同組織和不同發(fā)育時期的存在情況40-41
• 2.3.1 斑馬魚各組織和不同發(fā)育時期勻漿液的獲得40
• 2.3.2 Western blotting檢測40-41
• 2.4 斑馬魚zranb2基因序列的獲得41-47
• 2.4.1 斑馬魚胚胎總RNA提取41-42
• 2.4.2 斑馬魚胚胎總cDNA的獲得42-45
• 2.4.3 斑馬魚zranb2基因的克隆45-47
• 2.5 斑馬魚zranb2的序列分析、進化分析和基因組織結構分析47-48
• 2.6 Real-time PCR技術檢測斑馬魚zranb2的表達情況48-50
• 2.6.1 Real-time PCR所用實驗材料的獲得48
• 2.6.2 RNA的提取、cDNA模板的合成與檢測48
• 2.6.3 設計Real-time PCR特異性引物48-49
• 2.6.4 Real-time PCR擴增49-50
• 2.7 原位雜交技術檢測斑馬魚zranb2的表達情況50-53
• 2.7.1 合成探針50
• 2.7.2 原位雜交技術50-53
• 2.8 斑馬魚ZRANB2重組蛋白的體外表達53-57
• 2.8.1 斑馬魚ZRANB2體外表達載體的構建53-54
• 2.8.2 斑馬魚rZRANB2的體外表達54-55
• 2.8.3 斑馬魚rZRANB2的純化55-56
• 2.8.4 斑馬魚rZRANB2的濃縮56-57
• 2.9 斑馬魚rZRANB2與LPS結合能力的鑒定57-58
• 2.9.1 用NHS-LC-biotin標記rZRANB2和BSA57
• 2.9.2 ELISA技術檢測rZRANB2與LPS的結合情況57-58
• 2.9.3 ELISA技術檢測rZRANB2與脂質A的結合情況58
• 2.9.4 ELISA技術檢測rZRANB2與單糖的結合情況58
• 2.10 斑馬魚rZRANB2與細菌結合能力的鑒定58-59
• 2.10.1 大腸桿菌、鰻弧球菌和嗜水氣單胞菌的培養(yǎng)58-59
• 2.10.2 Western bloting技術分析重組蛋白與細菌的結合情況59
• 2.10.3 用異硫氰酸熒光素(FITC)標記法分析rZRANB2與細菌的結合能力59
• 2.11 斑馬魚rZRANB2的抗菌活性的驗證59-60
• 2.11.1 大腸桿菌、鰻弧球菌和嗜水氣單胞菌的培養(yǎng)59
• 2.11.2 斑馬魚rZRANB2對大腸桿菌和鰻弧球菌的抗菌活性的驗證59-60
• 2.11.3 斑馬魚rZRANB2對嗜水氣單胞菌的抗菌活性的驗證60
• 2.12 斑馬魚rZRANB2流式細胞術檢測60-61
• 2.13 斑馬魚胚胎中ZRANB2的抗菌活性的驗證61-62
• 2.13.1 檢測斑馬魚胚胎提取液中ZRANB2的抗菌活性61
• 2.13.2 檢測斑馬魚體內ZRANB2是否有胚胎防御作用61-62
• 2.14 斑馬魚胚胎中ZRANB2的濃度測定62
• 2.15 斑馬魚ZRANB2活性中心的探尋62-63
• 3 結果63-92
• 3.1 從斑馬魚胚胎提取液中高通量分離母源性免疫因子63-65
• 3.1.1 高通量分離斑馬魚母源性免疫因子的質譜結果63-64
• 3.1.2 Western blotting檢測斑馬魚ZRANB2在不同組織中的分布情況64-65
• 3.1.3 Western blotting檢測斑馬魚ZRANB2在不同時期胚胎中的表達情況65
• 3.2 斑馬魚zranb2基因的序列分析、結構分析、進化分析和共線性分析65-72
• 3.2.1 斑馬魚zranb2基因序列的獲得65-66
• 3.2.2 斑馬魚zranb2基因的序列分析66-70
• 3.2.3 斑馬魚ZRANB2結構分析70-71
• 3.2.4 斑馬魚ZRANB2進化分析71
• 3.2.5 斑馬魚zranb2基因的共線性分析71-72
• 3.3 斑馬魚zranb2在不同組織和不同時期的表達模式72-78
• 3.3.1 qRT-PCR檢測的斑馬魚zranb2在不同組織中的表達模式72-74
• 3.3.2 qRT-PCR檢測的斑馬魚zranb2在不同時期的表達模式74-76
• 3.3.3 WISH檢測的斑馬魚zranb2在不同組織中的表達模式76-78
• 3.4 斑馬魚rZRANB2的體外重組表達78-80
• 3.4.1 pET-28a/zranb2表達載體的構建78-79
• 3.4.2 斑馬魚rZRANB2的體外表達和純化79-80
• 3.4.3 斑馬魚rZRANB2的Western blotting鑒定80
• 3.5 斑馬魚rZRANB2與LPS結合情況的驗證80-81
• 3.6 斑馬魚rZRANB2與細菌結合情況的驗證81-83
• 3.6.1 Western blotting檢測結果81-82
• 3.6.2 FITC標記法的檢測結果82-83
• 3.7 斑馬魚rZRANB2體外抗菌活性的驗證83
• 3.8 斑馬魚rZRANB2流式細胞術檢測83-84
• 3.9 斑馬魚早期胚胎中ZRANB2的免疫防護作用的驗證84-87
• 3.9.1 斑馬魚早期胚胎提取液中ZRANB2抗菌活性的驗證84-85
• 3.9.2 斑馬魚早期胚胎中ZRANB2抗菌活性的驗證85-87
• 3.10 斑馬魚早期胚胎中ZRANB2濃度的確定87-89
• 3.11 斑馬魚ZRANB2截短后多肽的抗菌活性的驗證89-92
• 3.11.1 斑馬魚ZRANB2截短示意圖89
• 3.11.2 Z_(38/198)、Z_(1/37)和Z_(11/37)體外抗菌活性以及與LPS結合能力的驗證89-92
• 3.11.3 Z_(38/198)、Z_(1/37)和Z_(11/37)體內抗菌活性的驗證92
• 4 討論92-95
• 總結與展望95-96
• 參考文獻96-109
• 致謝109-110
• 個人簡歷110
• 發(fā)表的文章110

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