本文關(guān)鍵詞：柑橘遺傳圖譜構(gòu)建及類胡蘿卜素代謝調(diào)控研究

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【摘要】：類胡蘿卜素是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物,它不僅能為植物提供五彩斑斕的顏色,同時還能參與光合作用和激素合成等重要的生物學(xué)過程。β-胡蘿卜素作為一種主要的類胡蘿卜素,是人體維生素A的重要來源。此外,它做為人體必要的健康保護(hù)物能降低某些癌癥和心血管疾病的發(fā)病率。因此,研究植物β-胡蘿卜素的代謝調(diào)控具有十分重要的作用。柑橘由于富含類胡蘿卜素而成為研究類胡蘿卜素代謝調(diào)控的良好材料。本實(shí)驗(yàn)利用β-胡蘿卜素含量差異顯著親本的雜交群體構(gòu)建了高密度遺傳圖譜,同時我們還利用柚β-胡蘿卜素突變體材料和超量表達(dá)柑橘LCYb基因后大量積累p-胡蘿卜素的番茄材料對p-胡蘿卜素的代謝與調(diào)控進(jìn)行了研究,主要結(jié)果如下：1.柑橘雜交群體的創(chuàng)建及高密度分子遺傳圖譜的構(gòu)建1)利用高β-胡蘿卜素含量材料(黃肉t/溪蜜柚)作為母本,低β-胡蘿卜素含量材料(坪山柚)作為父本,構(gòu)建其F1代遺傳分離群體,總共得到了550株雜交后代。2)利用RAD-seq技術(shù)對親本及其124個雜種后代進(jìn)行了測序,根據(jù)親本SNP位點(diǎn)信息對子代得到的SNP分型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。進(jìn)而通過測序深度、孟德爾遺傳的卡方檢驗(yàn)及缺失率對這些SNP位點(diǎn)進(jìn)行過濾,最終得到了1,543個可用于構(gòu)建遺傳圖譜的可靠SNP位點(diǎn)。3)為便于圖譜間的整合及比較,我們從前人柚遺傳圖譜中篩選到了20個可用于本遺傳圖譜構(gòu)建的SSR引物。用篩選出來的多態(tài)性引物對本實(shí)驗(yàn)中的雙親及F1代遺傳群體(124個單株)進(jìn)行擴(kuò)增,對其分離情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。4)根據(jù)擬測交作圖原理,利用Joinmap4.0軟件對獲得的1,563個標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析,并構(gòu)建柚遺傳連鎖圖譜。這些標(biāo)記位點(diǎn)被定位在9條連鎖群上,總遺傳圖距為976.58 cM,標(biāo)記間平均距離為0.62 cM。大部分標(biāo)記在連鎖群上均勻分布,9個連鎖群上的標(biāo)記數(shù)目為81-285個,連鎖群長度為75.42-139.26 cM。5)利用這些標(biāo)記在遺傳圖譜及甜橙基因組的位置信息進(jìn)行共線性分析,結(jié)果顯示：大部分的標(biāo)記在二者間具有良好的共線性,這不僅說明本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建圖譜質(zhì)量的可靠性,也從一程度上證實(shí)了柚與甜橙極高的相似度。6)將本研究構(gòu)建的圖譜和其他研究者構(gòu)建的包含有20個共同SSR標(biāo)記位點(diǎn)的2張柚圖譜進(jìn)行比較分析。發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記不僅分群及相對位置一致,同時遺傳距離也極為接近,這更進(jìn)一步證明了本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的遺傳圖譜質(zhì)量可靠。這些共有的SSR標(biāo)記使得我們未來能夠進(jìn)行圖譜的整合,使本研究構(gòu)建的圖譜具有更加重要的應(yīng)用價值。2.t/溪蜜柚果皮橙色突變體性狀形成機(jī)理的初探1)利用HPLC測定了成熟期t/溪蜜柚有色層橙色突變體果皮中類胡蘿卜素的組成與含量變化。結(jié)果表明：突變體果皮中呈橙色是β-胡蘿卜素的大量累積所致,其β-胡蘿卜素的含量比野生型增加了10.5倍,并且總類胡蘿卜素的含量也增加了7.9倍。2)利用qRT-PCR測定了突變體(MT)及其野生型(WT)中類胡蘿卜素代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。結(jié)果表明：MT中上游基因PSY,PDS和CCS及下游基因CCD1、BCH和NCED2的表達(dá)量都顯著低于野生型。3)RNA-seq分析結(jié)果顯示：與WT相比共有303個基因在MT果皮中存在顯著差異表達(dá)(padj0.05),其中135個基因上調(diào)表達(dá),而168個基因下調(diào)表達(dá)。Pathway分析顯示,MT果皮中碳代謝、氨基酸的生物合成和淀粉與蔗糖代謝發(fā)生了顯著變化。4)GC-MS測定結(jié)果顯示：大多數(shù)可溶性糖和氨基酸的含量都發(fā)生了顯著變化。其中,MT大多數(shù)可溶性糖的含量都顯著降低,但卻大量積累了WT中幾乎檢測不到的天冬酰胺。綜合分析我們認(rèn)為,MT果皮中β-胡蘿卜素及總類胡蘿卜素的增加,一方面是由于類胡蘿卜素代謝下游基因下調(diào)表達(dá),另一方面是由于糖酵解加速產(chǎn)生的前體物質(zhì)增加而引起的。而上游合成基因的下調(diào)表達(dá)很有可能是由于類胡蘿卜素積累后的反饋調(diào)節(jié)作用所引起的。5)為了尋找參與p-胡蘿卜素代謝調(diào)控的關(guān)鍵基因,我們對另外一對β-胡蘿卜素突變體材料(果肉橙色突變體)也進(jìn)行了RNA-seq分析,共鑒定到了200個基因差異表達(dá),其中92個基因上調(diào)表達(dá),108個基因下調(diào)表達(dá)。對這兩對突變體材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)綜合分析后,我們找到了10個共同差異基因,這些基因主要參與脂肪酸代謝和抗性反應(yīng)。3.轉(zhuǎn)CsLCYb基因調(diào)控類胡蘿卜素代謝的研究1)利用實(shí)驗(yàn)室前期創(chuàng)制的類胡蘿卜素轉(zhuǎn)基因番茄材料,通過PCR篩選得到單拷貝純系植株T217-1用于后續(xù)研究。篩選得到的T2代CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)仍然呈現(xiàn)與T0代相似的黃色表型,說明該轉(zhuǎn)基因事件十分穩(wěn)定。2)選取CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄三個發(fā)育時期(綠熟期、破色期和成熟期)的果實(shí)及其野生型對照作為研究材料。HPLC分析結(jié)果表明：三個時期轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中β-胡蘿卜素及總類胡蘿卜素的含量都顯著增加,而α-支路的總類胡蘿卜素含量都明顯減少；成熟期轉(zhuǎn)基因果實(shí)中α-胡蘿卜素的含量顯著增加,同時還檢測到了野生型中沒有生成的紫黃質(zhì)。對三個時期CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)質(zhì)體發(fā)育及形態(tài)的研究發(fā)現(xiàn),其與野生型之間不存在明顯差異。3)利用qRT-PCR測定轉(zhuǎn)基因及野生型番茄果實(shí)三個時期類胡蘿卜素代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)。結(jié)果表明：在綠熟期,轉(zhuǎn)基因果實(shí)除了PDS和LCYe呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)外,其它基因均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)；在轉(zhuǎn)色期,轉(zhuǎn)基因果實(shí)上游所有基因均表現(xiàn)上調(diào)表達(dá),而下游基因LCYE、BCH和ZEP則呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)；在成熟期,轉(zhuǎn)基因番茄中除ZEP外的其它類胡蘿卜素合成基因均上調(diào)表達(dá)。三個時期轉(zhuǎn)基因果實(shí)中ZEP基因的表達(dá)都顯著低于野生型。4)芯片分析結(jié)果顯示,與對照相比共有93個基因在CsLCYb超量表達(dá)番茄果實(shí)中顯著差異表達(dá)(FDR≤0.05,差異倍數(shù)≥2),其中30個基因上調(diào)表達(dá),63個基因下調(diào)表達(dá)。GO分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因的生物學(xué)功能主要以結(jié)合、催化活性、水解酶活性和蛋白結(jié)合為主。進(jìn)一步利用KEGG對這些差異基因所參與的代謝途徑分析后發(fā)現(xiàn),次生代謝的合成和降解、脂類代謝、淀粉和蔗糖代謝以及光呼吸等代謝途徑在CsLCYb超量表達(dá)的番茄果實(shí)中發(fā)生顯著變化。5)根據(jù)類胡蘿卜素合成基因表達(dá)數(shù)據(jù),我們利用LC-MS對三個時期番茄果實(shí)的ABA含量進(jìn)行了測定,結(jié)果表明CsLCYb番茄果實(shí)中的ABA含量在三個時期都顯著低于野生型,這與基因表達(dá)數(shù)據(jù)十分吻合。根據(jù)芯片數(shù)據(jù),我們利用GC對三個發(fā)育時期番茄果實(shí)中可溶性糖的含量進(jìn)行了測定,結(jié)果表明：三個時期野生型與轉(zhuǎn)基因之間的蔗糖含量沒有明顯差異,而果糖和葡萄糖含量變化表現(xiàn)出一致的趨勢。轉(zhuǎn)基因果實(shí)中三個時期果糖和葡萄糖的含量均低于野生型,特別是成熟期的差異達(dá)到了極顯著水平。
【關(guān)鍵詞】：柑橘 番茄 β-胡蘿卜素 轉(zhuǎn)基因 芽變 RNA-seq 遺傳圖譜 RAD-seq
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S666
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 縮略詞表14-16
• 第一章 前言16-34
• 1. 課題的提出16-17
• 2. 前人研究進(jìn)展17-32
• 2.1 植物類胡蘿卜素研究進(jìn)展17-28
• 2.1.1 類胡蘿卜素概述17-18
• 2.1.2 植物類胡蘿卜素的生物合成途徑18-21
• 2.1.3 植物類胡蘿卜素合成的主要酶及基因21-23
• 2.1.4 植物類胡蘿卜素的代謝和調(diào)控23-28
• 2.2 類胡蘿卜素代謝調(diào)控研究的方法28-30
• 2.2.1 利用遺傳群體進(jìn)行研究28
• 2.2.2 利用色澤突變體進(jìn)行研究28-29
• 2.2.3 利用轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行研究29-30
• 2.3 柑橘類胡蘿卜素代謝及調(diào)控的研究進(jìn)展30-32
• 3. 本研究的目的和內(nèi)容32-34
• 第二章 柚雜交群體的創(chuàng)建及其高密度遺傳圖譜的構(gòu)建34-54
• 1. 引言34-35
• 2. 材料與方法35-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-40
• 2.2.1 花粉活性的檢測35-36
• 2.2.2 雜交授粉36
• 2.2.3 雜種苗的播種及移栽36
• 2.2.4 DNA的提取36-37
• 2.2.5 雜種鑒定37
• 2.2.6 RAD文庫的構(gòu)建及測序37-38
• 2.2.7 數(shù)據(jù)篩選及序列比對38-39
• 2.2.8 SNP標(biāo)記分離檢測39
• 2.2.9 作圖群體的SSR標(biāo)記分析39
• 2.2.10 分子遺傳圖譜的構(gòu)建39-40
• 3. 結(jié)果與分析40-50
• 3.1 花粉育性的檢測及雜種的獲得40
• 3.2 遺傳群體后代的雜種鑒定40-41
• 3.3 RAD-Seq分析41-42
• 3.4 測序數(shù)據(jù)處理及SNP標(biāo)記多態(tài)性分析42-44
• 3.5 F_1代作圖群體的SSR位點(diǎn)分析44-45
• 3.6 柚高密度遺傳圖譜的構(gòu)建及分析45-48
• 3.7 與前人報道的柚遺傳圖譜的比較48-50
• 4. 討論50-54
• 4.1 柑橘遺傳圖譜構(gòu)建中群體、分子標(biāo)記及其檢測方法的選擇50-51
• 4.2 柚高密度遺傳圖譜構(gòu)建51-52
• 4.3 與前人報道的柚遺傳圖譜的比較52-54
• 第三章 t/溪蜜柚果皮橙色突變體性狀形成機(jī)理的初探54-72
• 1. 引言54-55
• 2. 材料與方法55-59
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料55
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法55-59
• 2.2.1 類胡蘿卜素的HPLC分析55-56
• 2.2.2 RNA的提取56
• 2.2.3 Real time RT-PCR分析56-57
• 2.2.4 轉(zhuǎn)錄組分析57-58
• 2.2.5 可溶性糖和氨基酸的測定58-59
• 3. 結(jié)果與分析59-69
• 3.1 柚果皮橙色突變體的類胡蘿卜素含量分析59-60
• 3.2 柚果皮橙色突變體類胡蘿卜素合成基因的表達(dá)分析60
• 3.3 轉(zhuǎn)錄組測序分析60-66
• 3.3.1 測序產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)60-61
• 3.3.2 RNA-seq測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估61-62
• 3.3.3 基因組比對統(tǒng)計(jì)62-63
• 3.3.4 差異表達(dá)基因分析63-64
• 3.3.5 差異表達(dá)基因的GO分析64-66
• 3.3.6 差異表達(dá)的基因所涉及的代謝途徑66
• 3.4 利用qRT-PCR驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果66-67
• 3.5 橙色果皮突變體果皮中可溶性糖和氨基酸含量的測定67-68
• 3.6 利用兩對β-胡蘿卜素突變體材料篩選候選基因68-69
• 4. 討論69-72
• 4.1 橙色果皮突變體材料積累β-胡蘿卜素機(jī)理的初探69-70
• 4.2 橙色果皮突變體材料與橙色果肉突變體材料間的異同70-71
• 4.3 與β-胡蘿卜素調(diào)控相關(guān)的候選基因71-72
• 第四章 轉(zhuǎn)CsLCYb基因調(diào)控β-胡蘿卜素代謝的研究72-91
• 1. 引言72-73
• 2. 材料與方法73-78
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料73
• 2.2 研究方法73-78
• 2.2.1 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄的分子檢測73-74
• 2.2.2 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)RNA的提取74-75
• 2.2.3 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的表達(dá)分析75-76
• 2.2.4 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)類胡蘿卜素的測定和分析76
• 2.2.5 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)ABA含量的測定和分析76-77
• 2.2.6 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的透射電子顯微鏡觀察77
• 2.2.7 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的芯片分析77-78
• 2.2.8 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的可溶性糖含量分析78
• 3. 結(jié)果與分析78-87
• 3.1 單拷貝轉(zhuǎn)基因植株后代純系的篩選78-79
• 3.2 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的類胡蘿卜素分析79-81
• 3.3 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析81-82
• 3.4 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)ABA含量分析82
• 3.5 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的透射電鏡觀察82-83
• 3.6 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的芯片分析83-87
• 3.7 CsLCYb轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的可溶性糖含量分析87
• 4. 討論87-91
• 4.1 超量表達(dá)CsLCYb基因?qū)︻惡}卜素α-支路的代謝調(diào)控87-88
• 4.2 超量表達(dá)CsLCYb基因?qū)傤惡}卜素含量的影響88-89
• 4.3 超量表達(dá)CsLCYb基因?qū)ζ渌x途徑的影響89-91
• 第五章 總討論與未來研究展望91-97
• 參考文獻(xiàn)97-117
• 附錄Ⅰ RNA-seq鑒定到的橙色果皮突變體與其野生型間差異表達(dá)的基因117-132
• 附錄Ⅱ RNA-seq鑒定到的橙色果肉突變體與其野生型間差異表達(dá)的基因132-150
• 附錄Ⅲ 基因芯片鑒定到的CsLCYb番茄果實(shí)與其野生型間差異表達(dá)的基因150-154
• 附錄Ⅳ 博士期間發(fā)表的論文154-155
• 致謝155-156

【參考文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 龐曉明;用分子標(biāo)記研究柑橘屬及其近緣屬植物的親緣關(guān)系和枳的遺傳多樣性[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

2 徐娟;幾個柑桔產(chǎn)區(qū)果實(shí)色澤評價及紅肉臍橙（Citrus sinensis L.cv.Cara cara）果肉呈色機(jī)理初探[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

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本文編號：539753