本文關(guān)鍵詞：藍舌病病毒1型DNA疫苗及重組禽痘病毒載體疫苗的研究

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【摘要】：藍舌病(Bluetongue,BT)是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬藍舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的一種反芻動物的蟲媒傳染病,主要感染綿羊、山羊、牛、鹿和駱駝等。根據(jù)BTV表面蛋白VP2抗原性不同,BTV目前至少可以分為27個不同血清型,在我國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的血清型有BTV-1,2,3,4,12,15,16七個血清型,其中1型和16型是我國主要流行血清型。疫苗免疫是預(yù)防和控制藍舌病最有效的方法。目前,市場上應(yīng)用的藍舌病病毒疫苗主要是弱毒苗及滅活苗,但這兩種疫苗均存在一定的缺陷。滅活苗影響流行病學監(jiān)測,弱毒苗可能會產(chǎn)生毒力殘留及與流行野毒株發(fā)生基因重組。因此,研制新型的更為安全有效的疫苗對于藍舌病的防控顯得尤為重要。本研究分別構(gòu)建了3種表達藍舌病病毒1型(BTV-1)表面蛋白VP2、VP5及共表達(VP2+VP5)的重組禽痘病毒載體疫苗及重組DNA疫苗,分別命名為r FPV-VP2、r FPV-VP5、r FPV-(VP2+VP5)、p CAG-VP2、p CAG-VP5和p CAG-(VP2+VP5)。首先在BALB/c小鼠模型上對其免疫效果進行了系統(tǒng)評價。我們采取了3種不同的免疫策略:DNA疫苗首免及加免;r FPV疫苗首免及加免;DNA疫苗首免、r FPV疫苗加免。而每一種免疫策略中又包含了3種不同的免疫方式,即VP2單獨免疫組、VP2和VP5聯(lián)合免疫組以及共表達(VP2+VP5)組。結(jié)果表明,在3種免疫策略中,DNA疫苗首免、r FPV疫苗加免這一策略可以更好的誘導機體產(chǎn)生體液免疫及細胞免疫;而在每一種免疫策略中,共表達(VP2+VP5)免疫組的免疫效果均優(yōu)于VP2單獨免疫組或VP2和VP5聯(lián)合免疫組。在所有免疫組中,用DNA疫苗p CAG-(VP2+VP5)首免、r FPV-(VP2+VP5)加免是最佳的免疫策略,可以誘導產(chǎn)生最高的中和抗體及最佳的細胞免疫反應(yīng)�；谠谛∈髮嶒炆系慕Y(jié)果,本研究進一步將DNA疫苗p CAG-(VP2+VP5)首免、r FPV-(VP2+VP5)加免這一免疫策略在藍舌病本體動物綿羊上進行了系統(tǒng)的免疫評價。在綿羊上的研究結(jié)果表明,用p CAG-(VP2+VP5)首免、r FPV-(VP2+VP5)加免同樣可以在藍舌病本體動物綿羊上誘導產(chǎn)生高滴度的中和抗體及良好的細胞免疫反應(yīng)。在加強免疫后2周,中和抗體滴度最高可達188.36,高于文獻報道的BT重組金絲雀痘疫苗和VLP疫苗在綿羊上誘導產(chǎn)生的中和抗體滴度。BTV攻毒試驗需要在生物安全三級實驗室進行,由于試驗條件的限制,目前還未進行下一步的攻毒試驗。雖未進行攻毒保護的研究,但是據(jù)已有文獻報道,BTV疫苗免疫保護效果與中和抗體滴度和細胞免疫反應(yīng)有著密切的關(guān)系。本試驗用DNA疫苗p CAG-(VP2+VP5)首免、重組禽痘病毒疫苗r FPV-(VP2+VP5)加免后能夠產(chǎn)生高滴度的中和抗體和良好的細胞免疫反應(yīng),因此我們有理由推測用p CAG-(VP2+VP5)首免、r FPV-(VP2+VP5)加免這一免疫方式可以對綿羊提供良好的免疫保護。本研究構(gòu)建的藍舌病病毒1型DNA疫苗及重組禽痘病毒疫苗,在藍舌病的防控方面顯示了良好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：藍舌病病毒1型 DNA疫苗 重組禽痘病毒疫苗
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3
【目錄】：

• 附件3-5
• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 英文縮略表13-14
• 第一章 緒論14-23
• 1.1 藍舌病概述14
• 1.2 藍舌病的歷史和分布14-15
• 1.3 BTV基因組結(jié)構(gòu)和功能15-17
• 1.4 BTV的復(fù)制過程17-18
• 1.5 BTV的致病機制18-19
• 1.6 BT的預(yù)防19
• 1.7 BT疫苗的研究進展19-21
• 1.7.1 減毒活疫苗19
• 1.7.2 滅活疫苗19-20
• 1.7.3 病毒樣顆粒（VLP）20
• 1.7.4 重組活載體疫苗20-21
• 1.8 禽痘病毒的研究進展21
• 1.9 研究的目的和意義21-23
• 第二章 重組禽痘病毒載體的構(gòu)建23-36
• 2.1 材料23-24
• 2.1.1 病毒株和細胞23
• 2.1.2 質(zhì)粒載體23
• 2.1.3 抗體23
• 2.1.4 主要試劑23
• 2.1.5 試劑盒23-24
• 2.2 方法24-28
• 2.2.1 表達BTV1-VP5基因禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建24
• 2.2.2 表達BTV1-VP2基因禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建24
• 2.2.3 共表達BTV1-(VP2+VP5)基因禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建24-25
• 2.2.4 轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒的準備25-26
• 2.2.5 成纖維細胞的制備26
• 2.2.6 轉(zhuǎn)染26-27
• 2.2.7 重組禽痘病毒的篩選和純化27
• 2.2.8 重組禽痘病毒的鑒定27-28
• 2.3 結(jié)果28-34
• 2.3.1 表達BTV1-VP5基因禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體pSY681-gfp-gpt-VP5的鑒定結(jié)果28-29
• 2.3.2 表達BTV1-VP2基因禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體pSY681-gfp-gpt-VP2的鑒定結(jié)果29-30
• 2.3.3 共表達BTV1-(VP2+VP5) 基因禽痘病毒轉(zhuǎn)移載體pSY681-gfp-gpt- (VP2+VP5)的鑒定結(jié)果30-31
• 2.3.4 重組禽痘病毒的篩選和純化31
• 2.3.5 重組禽痘病毒的PCR鑒定31-32
• 2.3.6 rFPV的免疫熒光鑒定32
• 2.3.7 rFPV的western blot鑒定32-33
• 2.3.8 rFPV的生長曲線33-34
• 2.4 討論34-36
• 第三章 重組DNA疫苗的構(gòu)建36-42
• 3.1 材料36
• 3.1.1 細胞和抗體36
• 3.1.2 質(zhì)粒和載體36
• 3.1.3 主要試劑36
• 3.2 方法36-38
• 3.2.1 重組DNA疫苗pCAG- VP5的構(gòu)建36-37
• 3.2.2 重組DNA疫苗pCAG- VP2的構(gòu)建37
• 3.2.3 重組DNA疫苗pCAG- (VP2+VP5)的構(gòu)建37
• 3.2.4 重組DNA疫苗質(zhì)粒在 293T中的表達37-38
• 3.2.5 間接免疫熒光試驗38
• 3.3 結(jié)果38-40
• 3.3.1 重組DNA疫苗pCAG- VP5的酶切和PCR鑒定38
• 3.3.2 重組DNA疫苗pCAG- VP2的酶切和PCR鑒定38-39
• 3.3.3 重組DNA疫苗pCAG- (VP2+VP5)的酶切和PCR鑒定39-40
• 3.3.4 間接免疫熒光結(jié)果40
• 3.4 討論40-42
• 第四章 DNA疫苗及禽痘病毒重組疫苗在小鼠上的免疫評估42-56
• 4.1 材料和方法42-46
• 4.1.1 病毒株和細胞42
• 4.1.2 質(zhì)粒42
• 4.1.3 試劑42
• 4.1.4 實驗動物42
• 4.1.5 重組禽痘病毒的擴大培養(yǎng)及PFU的測定42-43
• 4.1.6 DNA疫苗重組質(zhì)粒的大量提取43
• 4.1.7 BTV1型SZ97/1 株病毒TCID50的測定43
• 4.1.8 真核表達重組VP2、VP5蛋白的擴大培養(yǎng)及純化43-44
• 4.1.9 動物實驗44
• 4.1.10 免疫后特異性抗體的檢測44-45
• 4.1.11 中和試驗45
• 4.1.12 淋巴細胞增值試驗45-46
• 4.1.13 細胞因子的檢測46
• 4.1.14 統(tǒng)計學分析46
• 4.2 結(jié)果46-54
• 4.2.1 重組禽痘病毒的擴大培養(yǎng)后PFU值46
• 4.2.2 BTV1型SZ97/1 株病毒TCID50的測定結(jié)果46-47
• 4.2.3 重組VP2、VP5蛋白的反應(yīng)原性鑒定47
• 4.2.4 疫苗免疫后特異性抗體反應(yīng)47-49
• 4.2.5 中和抗體滴度49
• 4.2.6 疫苗免疫后的淋巴細胞增殖反應(yīng)49-51
• 4.2.7 疫苗免疫后的細胞因子水平51-54
• 4.3 討論54-56
• 第五章 DNA疫苗及禽痘病毒重組疫苗在綿羊上的免疫評估56-62
• 5.1 材料和方法56-57
• 5.1.1 病毒株和細胞56
• 5.1.2 質(zhì)粒56
• 5.1.3 試劑56
• 5.1.4 實驗動物56
• 5.1.5 動物實驗56-57
• 5.1.6 免疫后特異性抗體的檢測57
• 5.1.7 中和試驗57
• 5.1.8 血清中細胞因子的檢測57
• 5.2 結(jié)果57-60
• 5.2.1 疫苗免疫后的特異性抗體的檢測57-59
• 5.2.2 中和試驗59
• 5.2.3 血清中細胞因子的檢測59-60
• 5.3 討論60-62
• 第六章 全文結(jié)論62-63
• 參考文獻63-73
• 致謝73-74
• 作者簡歷74

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 花群義,周曉黎,徐自忠,董俊;藍舌病病毒單克隆抗體的制備及生物學特性鑒定[J];中國獸醫(yī)科技;2000年09期

2 靖吉強,馬洪超,刁有祥;藍舌病病毒分子生物學研究進展[J];中國動物檢疫;2000年07期

3 ;藍舌病病毒(Bluetongue virus)可在胎兒內(nèi)越冬存活[J];中國動物保健;2008年07期

4 尹惠瓊;張紅;劉松婷;楊姝;史利軍;張改平;章金剛;;藍舌病病毒熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)[J];中國動物傳染病學報;2009年04期

5 苗海生;李樂;朱建波;肖雷;李華春;;冷藏藍舌病樣品的Real-time PCR檢測和病毒顆粒穩(wěn)定性研究[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年06期

6 苗海生;李樂;朱劍波;肖雷;李華春;;藍舌病病毒在細胞內(nèi)生長特性和在抗原快速純化中的應(yīng)用[J];畜牧獸醫(yī)雜志;2013年03期

7 張曉丁,楊素,石世匡,徐維佳,牛紅衛(wèi),貴向平;進口動物中首次分離出藍舌病病毒[J];中國獸醫(yī)雜志;1991年06期

8 李根;彭克高;;胰酶促進藍舌病病毒在細胞中增殖的報告[J];云南畜牧獸醫(yī);1991年03期

9 李志華;彭克高;;細胞培養(yǎng)直接分離藍舌病病毒[J];云南畜牧獸醫(yī);1991年03期

10 程建國;孫建強;李紅霞;賈作民;周建樂;敖特根花;斯琴;郝向陽;;內(nèi)蒙古藍舌病病毒株的某些生物學特性[J];獸醫(yī)導刊;1992年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 耿宏偉;楊濤;馬健男;孫恩成;王凌鳳;魏鵬;秦永麗;吳東來;;藍舌病病毒群特異性單克隆抗體的制備[A];中國畜牧獸醫(yī)學會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第八次學術(shù)研討會論文集[C];2010年

2 鮑曉偉;張泉鵬;黃勇;張富強;邱薇;范泉水;李剛山;李作生;;藍舌病病毒分子生物學研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十二次學術(shù)研討會論文集[C];2007年

3 尹惠瓊;楊姝;張立營;張紅;呂茂民;李文超;張改平;章金剛;;藍舌病病毒系列診斷檢測技術(shù)研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第七次研討會論文集[C];2008年

4 楊俊興;花群義;盧體康;呂建強;秦智峰;陶虹;阮周曦;陳兵;林慶燕;;檢測藍舌病病毒雙抗夾心ELISA方法的建立及應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2009年

5 尹惠瓊;賈茗嫻;王蕊;楊姝;王升啟;章金剛;;納米探針檢測新技術(shù)及其在藍舌病病毒檢測中的應(yīng)用[A];2012全國臨床微生物與感染免疫學術(shù)研討會論文集[C];2012年

6 張泉鵬;鮑曉偉;黃勇;張富強;邱薇;范泉水;李剛山;李作生;;藍舌病病毒檢測和免疫[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十二次學術(shù)研討會論文集[C];2007年

7 徐倩倩;郭時金;周春鳳;張穎;王艷萍;張志美;楊麗梅;沈志強;;rRT-PCR檢測藍舌病病毒的研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學分會第三次學術(shù)研討會論文集[C];2012年

8 王文世;孫恩成;劉霓紅;楊濤;徐青元;秦永麗;趙晶;馮瑜菲;魏鵬;張翠云;李文京;吳東來;;藍舌病病毒VP7蛋白單克隆抗體的制備及生物學特性鑒定[A];2012年中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會暨中國病理生理學會動物病理生理專業(yè)委員會學術(shù)研討會論文集[C];2012年

9 秦永麗;孫恩成;耿宏偉;徐青元;楊濤;趙晶;王文世;魏鵬;馮瑜菲;李俊平;李文京;吳東來;;藍舌病病毒8型VP2蛋白單克隆抗體制備及其抗原表位鑒定[A];2012年中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會暨中國病理生理學會動物病理生理專業(yè)委員會學術(shù)研討會論文集[C];2012年

10 魏鵬;孫恩成;劉霓紅;楊濤;徐青元;秦永麗;趙晶;馮瑜菲;王文世;張翠云;吳東來;;抗藍舌病病毒VP6和VP7蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[A];2012年中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會暨中國病理生理學會動物病理生理專業(yè)委員會學術(shù)研討會論文集[C];2012年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 吳志軍邋薜荃 郝成濤;我國藍舌病病毒檢測技術(shù)研究處于世界先進水平[N];科技日報;2008年

2 吳志軍邋薜荃 郝成濤;軍事醫(yī)學科學院研制成功藍舌病病毒檢測試劑盒[N];中國醫(yī)藥報;2008年

3 吳志軍邋薜荃 郝成濤;藍舌病病毒檢測試劑盒研制成功[N];健康報;2008年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李俊平;藍舌病病毒1型DNA疫苗及重組禽痘病毒載體疫苗的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

2 耿宏偉;藍舌病病毒群特異性構(gòu)象抗原表位的初步鑒定及競爭ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2012年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 劉松婷;藍舌病病毒四種檢測技術(shù)比較研究[D];揚州大學;2010年

2 宋紅梅;藍舌病病毒VP7蛋白的原核表達及單克隆抗體的制備[D];西北農(nóng)林科技大學;2010年

3 李文超;藍舌病病毒VP7蛋白的原核表達及單克隆抗體的制備[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2007年

4 趙大維;藍舌病病毒VP3、5、7蛋白及小反芻獸疫病毒H蛋白的原核表達及其抗原性分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2011年

5 席娜;藍舌病病毒8型VP2蛋白單克隆抗體的制備及B細胞表位鑒定[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2014年

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本文編號：520935