本文關(guān)鍵詞：烏桕花芽轉(zhuǎn)錄組測序分析及花發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 能源植物 烏桕 花發(fā)育 轉(zhuǎn)錄組測序 花發(fā)育關(guān)鍵基因 脅迫誘導(dǎo)早花 VIGS

【摘要】：烏桕屬大戟科落葉喬木,為中國特有的經(jīng)濟(jì)樹種,已有1400多年的栽培歷史。兼具藥用、觀賞、工業(yè)油料等用途,經(jīng)濟(jì)價值高。但烏桕幼年期較長,許多性狀要在成年期才表現(xiàn)出來,很大程度上限制了烏桕遺傳育種及其相關(guān)研究工作進(jìn)展。因此,促進(jìn)烏桕提早開花,縮短其幼年期,對加速該樹種的遺傳改良周期具有積極作用。論文首次對烏桕花器官發(fā)育進(jìn)程進(jìn)行解剖觀測,利用illumina技術(shù)平臺對烏桕花芽進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序,對花發(fā)育過程中相關(guān)關(guān)鍵基因和代謝調(diào)控通路進(jìn)行生物信息學(xué)分析；然后利用測序信息克隆了烏桕開花相關(guān)基因SsLFY和MADS-box (SsAP1、SsTFL、SsAP2、SsCO、SsFUL)等關(guān)鍵基因；同時在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平對環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的烏桕早花材料進(jìn)行了分析；并建立了烏桕功能基因VIGS鑒定體系,獲得了一系列開創(chuàng)性的研究結(jié)果。豐富了烏桕花發(fā)育的生物學(xué)理論,為進(jìn)一步研究烏桕開花調(diào)控機(jī)制和開發(fā)利用提供了重要的科學(xué)依據(jù)。本研究的主要結(jié)論如下：1.烏桕花發(fā)育解剖學(xué)研究采用石蠟切片法對烏桕花發(fā)育顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,根據(jù)顯微結(jié)構(gòu)特征將烏桕花的形態(tài)分化劃分為5個時期：花序原基分化期、雄花小花原基分化期、雄花花粉分化期及雌花原基分化期、雄花花粉成熟及雌蕊分化期、雌花子房形成期。根據(jù)形態(tài)觀察對烏桕花發(fā)育階段進(jìn)行了重新劃分,分成6個階段：花序芽膨大、花序出現(xiàn)、花序繼續(xù)伸長、雄花部分開放同時底部雌花芽膨大、雄花完全開放伴隨雌花芽出現(xiàn)、雌花完全開放。2.烏桕花芽轉(zhuǎn)錄組測序分析應(yīng)用HiSeq2500平臺對烏桕花芽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,測序數(shù)據(jù)共產(chǎn)生堿基數(shù)約合6.47G,總共進(jìn)行了64,663,388次讀數(shù),總共產(chǎn)生149,342條Unigene,平均長度為635bp,其中長度在1kb以Unigenes有67,577條,占Unigene庫總數(shù)的45.25%。對樣本轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了GO注釋分類和KEGG代謝通路分析,獲得Unigenes的注釋信息,總注釋的Unigenes為129,434個。在所有的Unigene中,有70個基因的FPKM值超過6000,表明在花序中高表達(dá)。借助隱式馬爾可夫模型對烏桕MADS box基因進(jìn)行了鑒定并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,烏桕的MADS box可以整合到擬南芥的MADS box進(jìn)化枝中,發(fā)現(xiàn)烏桕中有24個基因可確認(rèn)為Ⅱ型(MIKC) MADS-box基因,其余14個可分別歸類到Mα、 Mγ、Mδ和AGL33類型的MADS-box基因中。然后對烏桕花發(fā)育調(diào)控通路、脂肪酸合成代謝通路、環(huán)境脅迫基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了預(yù)測。3.烏桕花發(fā)育相關(guān)基因的克目前,基于模式植物擬南芥花發(fā)育關(guān)鍵基因的研究結(jié)果,木本植物中,如柑橘、葡萄、楊樹、蘋果、核桃等很多開花調(diào)控基因也已被分離出來,但Genbank上未見烏桕花發(fā)育基因的序列,更沒有對其功能和表達(dá)特性研究的報道。本文以葡萄桕為材料,借助烏桕花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出花發(fā)育的候選基因,利用RACE技術(shù)克隆并驗證篩選出的候選基因序列(如TFL1、LFY、API、CO、AP2、FUL等),利用半定量RT-PCR分析這些基因的組織特異性表達(dá)情況,并對其功能進(jìn)行初步的鑒定分析,為研究烏桕花發(fā)育分子機(jī)理以及植物的花期調(diào)控奠定基礎(chǔ)。4.烏桕功能基因VIGS鑒定體系的建立隨著人們對病毒誘導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象的不斷研究,VIGS逐漸成為人們用來研究植物基因功能的反向遺傳學(xué)手段,提供了一個快速便捷的鑒定目標(biāo)基因功能的方法。本文以不同指示基因SsPDS和SsAS1為研究對象,通過插入不同區(qū)段的SsPDS基因片段(5'和3'端)和不同長度的SsAS1基因片段(493bp和323bp),構(gòu)建pTRV病毒表達(dá)載體,通過注射的方式將帶有TRV2-SsPDS的農(nóng)桿菌GV3101菌液導(dǎo)入烏桕葉片,三周后可觀察到烏桕頂端新生葉片出現(xiàn)光漂白,五周后光漂白現(xiàn)象更加明顯。同時采用半定量RT-PCR比較不同長度片段和區(qū)段對病毒積累量和沉默效率之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,被侵染的烏桕表現(xiàn)出明顯的光漂白現(xiàn)象,半定量RT-PCR分析表明,與對照相比,SsPDS基因的mRNA被顯著降解。以構(gòu)建病毒載體pTRV-SsAS1,侵染烏桕葉片驗證建立的TRV-VIGS技術(shù)體系。結(jié)果表明,被侵染的烏桕表現(xiàn)出明顯的葉片不規(guī)則皺縮現(xiàn)象,半定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)侵染的烏桕中SsAS1基因的mRNA被顯著降解。成功建立了利用TRV-VIGS載體的高效烏桕基因沉默體系建立烏桕的VIGS技術(shù)體系,為烏桕花發(fā)育基因的功能鑒定提供快速可行的實驗體系。5.脅迫誘導(dǎo)烏桕早花的分析干旱、高鹽、低溫、高光強(qiáng)等逆境條件下,植物通過改變生理過程而減少逆境對細(xì)胞的傷害,同時會提前開花以盡早完成其生命周期,該生物學(xué)現(xiàn)象被稱為“逆境誘導(dǎo)的開花”。本章通過在溫室內(nèi)模擬盆栽實驗,探索了高溫和干旱協(xié)同脅迫誘導(dǎo)烏桕幼苗早花的條件,并從轉(zhuǎn)錄和蛋白組水平分析了相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對逆境脅迫的響應(yīng)的差異。研究發(fā)現(xiàn),模擬高溫十旱處理烏桕三個月左右,處理組的20株一年生烏桕幼苗中有4株出現(xiàn)了肉眼可見的花芽。半定量RT-PCR技術(shù)對烏桕轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中花發(fā)育關(guān)鍵基因進(jìn)行了分析。顯示一年生和兩年生烏桕中花發(fā)育相關(guān)基因AG、GA1、SPY、SOC1、AP2、AP3、VRN2、RIP、CRY2等在早花組和對照組中的表達(dá)均有不同差異,同時GRX50435、GRX29400、CAT97419、SOD28463, PRXII25514、PRXII39562、PRX25913氧化還原調(diào)節(jié)相關(guān)基因和SEBIN的表達(dá)量均有很大提高,我們推測CAT、PRX、GRX和SOD在干旱脅迫誘導(dǎo)的烏桕早花過程發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。此外,借助雙向電泳技術(shù)分離了烏桕植株的總蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,在41個差異表達(dá)的蛋白中,選取25個相對豐度較高的蛋白用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜進(jìn)行了鑒定,10個蛋白得到了成功鑒定。在這些蛋白中,主要是一些與物質(zhì)及能量代謝、光合作用、氧化脅迫反應(yīng)、逆境響應(yīng)相關(guān)蛋白。其中3個蛋白為參與糖代謝的酶,包括果糖二磷酸醛縮酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和磷酸核酮糖激酶,主要是為了增加碳水化合物的合成。其余7個蛋白分別是放氧增強(qiáng)蛋白1、光體系Ⅰ亞基Ⅶ、脫落酸脅迫催熟類蛋白、滲調(diào)蛋白、S-腺苷高半胱氨酸核苷酶、抗壞血酸過氧化物酶和過氧化物酶,主要參與其它生理過程。這些蛋白的產(chǎn)生能提高植物細(xì)胞滲透勢,對維持脫水狀態(tài)下的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是非常必要的。本論文對烏桕花發(fā)育相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究,并建立了相關(guān)烏桕VIGS功能基因鑒定體系,同時還對脅迫誘導(dǎo)烏桕早花進(jìn)行了探索,分別在轉(zhuǎn)錄組和蛋白組水平對相關(guān)基因和蛋白進(jìn)行了分析,對于烏桕的遺傳育種及其相關(guān)研究具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：能源植物 烏桕 花發(fā)育 轉(zhuǎn)錄組測序 花發(fā)育關(guān)鍵基因 脅迫誘導(dǎo)早花 VIGS
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S792.99
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 第1章 緒論14-26
• 1.1 引言14-15
• 1.2 烏桕應(yīng)用價值及生物學(xué)特性15-20
• 1.2.1 應(yīng)用價值15-18
• 1.2.2 生物學(xué)特性18-20
• 1.3 植物花發(fā)育的研究進(jìn)展20-24
• 1.3.1 高等植物的成花過程20-21
• 1.3.2 花發(fā)育相關(guān)基因的研究進(jìn)展21-23
• 1.3.3 環(huán)境因子對花發(fā)育的調(diào)控23-24
• 1.4 主要研究內(nèi)容及技術(shù)路線24-26
• 第2章 烏桕花發(fā)育形態(tài)學(xué)研究及其轉(zhuǎn)錄組測序分析26-46
• 2.1 引言26
• 2.2 實驗材料與方法26-29
• 2.2.1 材料26-27
• 2.2.2 試劑27
• 2.2.3 主要儀器設(shè)備27
• 2.2.4 烏桕花芽石蠟制片方法27-28
• 2.2.5 總RNA的提取及純化28
• 2.2.6 烏桕花芽轉(zhuǎn)錄組Illumina高通量測序及分析28-29
• 2.3 結(jié)果29-46
• 2.3.1 烏桕花芽分化的顯微結(jié)構(gòu)觀察30-32
• 2.3.2 烏桕花發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)觀察32-33
• 2.3.3 RNA提取33-34
• 2.3.4 原始測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計34-35
• 2.3.5 Unigenes功能注釋35-36
• 2.3.6 GO和KEGG富集分析36-37
• 2.3.7 MADS box基因鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建37-39
• 2.3.8 烏桕花發(fā)育調(diào)控通路的預(yù)測39-42
• 2.3.9 烏桕脂肪酸合成代謝通路的預(yù)測42-43
• 2.3.10 烏桕環(huán)境脅迫基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測43-46
• 第3章 烏桕花發(fā)育關(guān)鍵基因研究46-84
• 3.1 引言46
• 3.2 實驗材料與方法46-53
• 3.2.1 植物材料46
• 3.2.2 主要試劑46-47
• 3.2.3 實驗方法47-53
• 3.3 結(jié)果53-82
• 3.3.1 烏桕SsLFY基因的克隆及功能分析53-63
• 3.3.2 烏桕SsTFL1基因的克隆及功能分析63-67
• 3.3.3 烏桕SsAP1基因的克隆及序列分析67-71
• 3.3.4 烏桕SsAP2基因的克隆及序列分析71-75
• 3.3.5 烏桕SsCO基因的克隆及序列分析75-79
• 3.3.6 烏桕SsFUL基因的克隆及序列分析79-82
• 3.4 小結(jié)82-84
• 第4章 烏桕VIGS功能基因鑒定體系的建立84-98
• 4.1 引言84
• 4.2 實驗材料與方法84-88
• 4.2.1 實驗材料84-85
• 4.2.2 質(zhì)粒與菌種85
• 4.2.3 實驗儀器85
• 4.2.4 試劑85
• 4.2.5 實驗方法85-88
• 4.3 結(jié)果88-95
• 4.3.1 烏桕P(guān)DS和AS1同源基因的克隆88
• 4.3.2 烏桕P(guān)DS和AS1同源基因的克隆88-89
• 4.3.3 VIGS病毒載體的構(gòu)建89-90
• 4.3.4 烏桕P(guān)DS基因VIGS實驗體系的建立90-94
• 4.3.5 烏桕AS1基因驗證VIGS體系94-95
• 4.4 小結(jié)95-98
• 第5章 干旱脅迫誘導(dǎo)烏桕早花研究98-114
• 5.1 引言98-99
• 5.2 實驗材料與方法99-103
• 5.2.1 試劑99
• 5.2.2 實驗儀器99
• 5.2.3 溶液配制99
• 5.2.4 實驗方法99-103
• 5.3 結(jié)果103-110
• 5.3.1 干旱脅迫誘導(dǎo)的早花烏桕103-104
• 5.3.2 脅迫誘導(dǎo)的早花烏桕轉(zhuǎn)錄水平分析104-106
• 5.3.3 脅迫誘導(dǎo)的早花烏桕蛋白水平分析106-110
• 5.4 討論110-114
• 結(jié)論114-116
• 參考文獻(xiàn)116-126
• 附錄126-148
• 致謝148-150
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的其他研究成果150-151

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王洋;姜衛(wèi)兵;魏家星;韓鍵;翁忙玲;;烏桕的園林特性及開發(fā)應(yīng)用[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年15期

2 陳余朝;劉瑞蘭;;烏桕育苗及造林技術(shù)[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2008年14期

3 王森;;烏桕能源林的培育[J];安徽林業(yè);2010年Z1期

4 張小紅;;烏桕的園林應(yīng)用與栽培[J];林業(yè)與生態(tài);2012年08期

5 陳景震;張良波;李培旺;;烏桕開發(fā)利用研究進(jìn)展[J];湛江師范學(xué)院學(xué)報;2012年03期

6 魏永進(jìn);;烏桕的繁育與栽培[J];安徽林業(yè);2006年05期

7 楊艷;李昌珠;蔣麗娟;聞麗;張良波;李培旺;;烏桕文獻(xiàn)計量學(xué)分析[J];經(jīng)濟(jì)林研究;2014年01期

8 劉錫輝;秦新生;梁同軍;林森;;石灰?guī)r特有植物圓葉烏桕土壤與葉片化學(xué)元素含量特征[J];西南農(nóng)業(yè)學(xué)報;2013年03期

9 王昌銘;;不容忽視的樹種——山烏桕[J];廣東林業(yè)科技;2012年02期

10 黎章矩,夏逍鴻;對烏桕變種劃分的意見[J];浙江林業(yè)科技;1981年03期

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 張小紅;烏桕的景觀應(yīng)用和栽培技術(shù)[N];中國花卉報;2006年

2 江西 鄭小春 吳茂隆 劉忠源;山烏桕播種育苗（上）[N];中國花卉報;2005年

3 省經(jīng)濟(jì)林與林木種苗工作站 李紅衛(wèi)提供;烏桕[N];河南科技報;2004年

4 侯伯鑫　林峰;烏桕[N];中國花卉報;2005年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 吳影;烏桕花芽轉(zhuǎn)錄組測序分析及花發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

2 楊永峰;烏桕抑螺效果及其機(jī)理的研究[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2010年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 田良濤;烏桕胚乳三倍體植株再生與轉(zhuǎn)基因研究[D];湖北大學(xué);2011年

，

本文編號：523490