本文關(guān)鍵詞：綠盲蝽對常用殺蟲藥劑的抗藥性監(jiān)測及其抗藥性機(jī)制分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉在我國的廣泛種植導(dǎo)致處于次要地位的棉盲蝽猖獗躍居為棉田主要害蟲并為害多種作物。在田間,防治棉盲蝽過度依賴殺蟲劑不可避免的會產(chǎn)生抗藥性問題。本文針對棉田常用殺蟲劑對我國棉區(qū)冀魯皖豫四省六個(gè)地區(qū)綠盲蝽種群的抗性水平及其解毒酶活性進(jìn)行了系統(tǒng)監(jiān)測,旨在明確綠盲蝽對常用藥劑的抗性發(fā)展動態(tài)。同時(shí)對室內(nèi)選育的綠盲蝽高效氯氟氰菊酯抗性品系進(jìn)行抗性機(jī)理的研究。這些研究結(jié)果為綠盲蝽的高效和可持續(xù)防控提供科學(xué)依據(jù)。1.綠盲蝽對六種常用殺蟲劑的抗藥性監(jiān)測根據(jù)敏感基線確立的殺蟲劑的LD99診斷計(jì)量,通過玻璃管藥膜法在2013及2014年對冀魯皖豫四省六個(gè)地區(qū)的田間綠盲蝽種群進(jìn)行抗性監(jiān)測。其中,2014年山東濱州綠盲蝽種群在高效氯氟氰菊酯、吡蟲啉、滅多威及硫丹LD99診斷計(jì)量下的死亡率分別為45%、60%、67%與8%,表明該地區(qū)綠盲蝽種群已對上述四種殺蟲劑產(chǎn)生一定程度的抗性。2014年河北邱縣、安徽望江、安徽無為及河南西華四個(gè)田間種群在硫丹診斷劑量下死亡率為50%左右,暗示這4個(gè)種群已對硫丹產(chǎn)生一定程度的抗性。點(diǎn)滴法測定2013年及2014年冀魯皖豫四省六地區(qū)的綠盲蝽種群的抗性水平。與室內(nèi)敏感種群相比,2014年六個(gè)種群對馬拉硫磷的抗性倍數(shù)較2013年略有上升；2014年安徽無為種群對毒死蜱的抗性倍數(shù)為7.8倍；2014年六個(gè)種群對硫丹的抗性倍數(shù)較2013年顯著上升；2014年山東濱州種群對高效氯氟氰菊酯的抗性倍數(shù)高達(dá)29.9倍,而其他種群的抗性倍數(shù)僅為1.3-2倍之間；2014年田間種群對滅多威與2013年基本持平；2014年六個(gè)種群對吡蟲啉的抗性倍數(shù)較2013年略有上升。通過動力學(xué)法比較田間種群與室內(nèi)敏感品系的解毒酶活性水平差異。與室內(nèi)敏感品系相比,田間種群的羧酸酯酶(CarE)及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)活性分布在600-800 mOD/(min-頭)區(qū)段的個(gè)體頻率偏高；乙酰膽堿酯酶活性分布在18mOD/(min頭)區(qū)段的個(gè)體頻率偏高于敏感品系,這與田間種群對殺蟲劑的抗性水平有關(guān)。2.綠盲蝽鈉離子通道的克隆及特征采用RT-PCR結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE),將綠盲蝽鈉離子通道基因進(jìn)行克隆并對其可變剪接模式進(jìn)行分析。最終得到全長為6858bp的綠盲蝽鈉離子通道,其中開放閱讀框ORF框?yàn)?087bp,共編碼2028個(gè)氨基酸,命名為AlVSSC (GenBank accession number:KR139855)、523bp的5’UTR區(qū)和248bp的3’UTR區(qū)。A1VSSC蛋白具有鈉離子通道蛋白所有保守結(jié)構(gòu)及特征。綠盲蝽AlVSSC基因編碼區(qū)包含六個(gè)可選擇外顯子(A、B、C、D、E、F)與一對互斥型外顯子(K/L)。3.綠盲蝽抗高效氯氟氰菊酯品系與抗性相關(guān)基因的表達(dá)差異分析采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,對室內(nèi)綠盲蝽高效氯氟氰菊酯抗性品系中相關(guān)的解毒代謝基因P450進(jìn)行表達(dá)量的驗(yàn)證,結(jié)果表明CYP6X2、CYP6JB1、CYP6HM1及CYP395H1均在抗性篩選過程中發(fā)生顯著性上調(diào)(2.5-21.6倍),其中綠盲蝽的CYP6X2表達(dá)量較敏感品系上調(diào)達(dá)21.6倍；在高效氯氟氰菊酯LD20劑量下,敏感品系與抗性品系的CYP6X2 mRNA水平均能夠被誘導(dǎo),分別為誘導(dǎo)前的1.8與1.6倍。4.解毒酶P450基因(CYP6X2、CYP6JB1、CYP6HM1、CYP395H1)的真核表達(dá)通過昆蟲桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)對可能與高效氯氟氰菊酯抗性有關(guān)的4個(gè)P450基因(CYP6X2、CYP6JB1、CYP6HM1、CYP395H1)進(jìn)行表達(dá),并通過Western blot進(jìn)行是否表達(dá)驗(yàn)證,最后檢測ECOD活性,上述4個(gè)P450蛋白的脫乙基活性分別為115.46±5.06、95.3±7.4、61.94±10.48及148.8±8.54pmoles 7-羥基香豆素/min/mg protein,從而為蛋白代謝高效氯氟氰菊酯奠定基礎(chǔ)。5. CYP6X2的啟動子初探采用染色體步移法獲得綠盲蝽CYP6X2的5’側(cè)翼啟動子序列,長度為1916 bp。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測其上可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),例如HSF、Dfd、Bcd、GATA、GCM及XRE-AhR等。構(gòu)建至報(bào)告基因載體pGL-4.1basic檢測不同長度啟動子的熒光素梅活性,發(fā)現(xiàn)1820bp的啟動子活性最高。6.山東濱州綠盲蝽種群對高效氯氟氰菊酯抗性機(jī)制的研究對比羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、多功能氧化酶的活性在山東濱州種群與室內(nèi)敏感種群的差異,未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。比較兩種群鈉離子通道序列,發(fā)現(xiàn)經(jīng)典點(diǎn)突變L1015F僅存在于山東濱州種群,該地區(qū)種群野生純合型、雜合型、突變純合型的頻率分別為33.87、53.23與12.9%,且該基因的突變組合型處于Hardy-Weinberg (H-W)平衡。7.2014年河北滄州種群對有機(jī)磷殺蟲劑的抗性采用點(diǎn)滴法對河北滄州種群進(jìn)行毒死蜱及馬拉硫磷的抗藥性監(jiān)測。與室內(nèi)敏感品系相比,該田間種群對毒死蜱及馬拉硫磷產(chǎn)生的抗性分別為10.7與15.5倍。通過解毒酶活性比較與靶標(biāo)乙酰膽堿酯酶序列的對比,明確該田間種群對有機(jī)磷產(chǎn)生抗性的原因是在AlAChEl中的A216S,且在河北滄州和山東濱州種群中,突變純合型的頻率分別為100與80%。
【關(guān)鍵詞】：綠盲蝽 抗藥性監(jiān)測 高效氯氟氰菊酯 鈉離子通道 P450表達(dá)量 毒死蜱 A216S
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S433
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-32
• 1.1 綠盲蝽的簡述14-16
• 1.1.1 綠盲蝽的形態(tài)特征14
• 1.1.2 綠盲蝽的生活史14-15
• 1.1.3 綠盲蝽的主要習(xí)性15
• 1.1.4 綠盲蝽的危害特點(diǎn)15
• 1.1.5 綠盲蝽的寄主15-16
• 1.1.6 綠盲蝽的分布區(qū)域16
• 1.2 盲蝽的抗藥性現(xiàn)狀16-19
• 1.2.1 國外盲蝽的抗藥性現(xiàn)狀16-18
• 1.2.2 國內(nèi)盲蝽的抗藥性現(xiàn)狀18-19
• 1.3 盲蝽蟓對殺蟲劑的抗性機(jī)理19-20
• 1.3.1 盲蝽蟓對有機(jī)磷類殺蟲劑的抗性機(jī)理19-20
• 1.3.2 盲蝽蟓對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性機(jī)理20
• 1.3.3 盲蝽蟓對新煙堿類殺蟲劑的抗性機(jī)理20
• 1.4 擬除蟲菊酯類藥劑的代謝20-30
• 1.4.1 擬除蟲菊酯殺蟲劑的特點(diǎn)20-21
• 1.4.2 擬除蟲菊酯殺蟲劑的靶標(biāo)位點(diǎn)——鈉離子通道21-24
• 1.4.3 昆蟲對擬除蟲菊酯殺蟲劑的抗性研究24-30
• 1.5 本研究的目的與意義30-32
• 第二章 綠盲蝽田間種群對六種常用殺蟲劑的抗藥性監(jiān)測32-45
• 2.1 方法與材料32-34
• 2.1.1 供試?yán)ハx32-33
• 2.1.2 供試藥劑33
• 2.1.3 抗性監(jiān)測方法33-34
• 2.1.4 解毒酶活性測定34
• 2.2 結(jié)果分析34-43
• 2.2.1 診斷劑量法檢測各地綠盲蝽種群的抗性個(gè)體頻率34-37
• 2.2.2 利用點(diǎn)滴法測定六種藥劑對2013年及2014年各地綠盲蝽種群的毒力37-41
• 2.2.3 田間種群的解毒酶活性水平41-43
• 2.3 小結(jié)與討論43-45
• 第三章 綠盲蝽鈉離子通道基因的克隆45-62
• 3.1 材料與方法45-54
• 3.1.1 供試?yán)ハx45
• 3.1.2 試劑45-46
• 3.1.3 試劑的配制46
• 3.1.4 主要儀器46
• 3.1.5 引物設(shè)計(jì)46-47
• 3.1.6 總RNA的提取47-48
• 3.1.7 反轉(zhuǎn)錄48-49
• 3.1.8 PCR擴(kuò)增、回收、連接、轉(zhuǎn)化及測序分析49-53
• 3.1.9 熒光定量PCR反應(yīng)53-54
• 3.1.10 序列測定及分析54
• 3.2 結(jié)果54-60
• 3.2.1 綠盲蝽鈉離子通道基因的克隆54-57
• 3.2.2 綠盲蝽鈉離子通道基因的選擇性剪切外顯子57-58
• 3.2.3 綠盲蝽鈉離子通道基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析58-59
• 3.2.4 綠盲蝽鈉離子通道基因mRNA的時(shí)空表達(dá)特征59-60
• 3.3 討論60-62
• 第四章 高效氯氟氰菊酯選育過程中P450基因的作用62-77
• 4.1 材料與方法62-65
• 4.1.1 供試綠盲蝽及飼養(yǎng)方法62
• 4.1.2 試劑62
• 4.1.3 儀器62
• 4.1.4 總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成62-63
• 4.1.5 鈉離子通道基因的比較63
• 4.1.6 引物的設(shè)計(jì)63-65
• 4.1.7 熒光定量PCR65
• 4.1.8 RT-PCR、3’RACE與5’RACE65
• 4.1.9 數(shù)據(jù)分析65
• 4.2 結(jié)果65-76
• 4.2.1 綠盲蝽高效氯氟氰菊酯抗性選育動態(tài)變化65-66
• 4.2.2 篩選過程中鈉離子通道氨基酸序列的比較66
• 4.2.3 高效氯氟氰菊酯篩選過程中P450基因的表達(dá)量66-67
• 4.2.4 LD20處理誘導(dǎo)CYP6X2的表達(dá)量67
• 4.2.5 高效氯氟氰菊酯篩選過程中相關(guān)P450基因的克隆67-72
• 4.2.6 相關(guān)P450基因的跨膜區(qū)及信號肽分析72
• 4.2.7 相關(guān)P450基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析72-74
• 4.2.8 細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)的克隆及系統(tǒng)進(jìn)化分析74-76
• 4.3 討論76-77
• 第五章 P450基因的真核表達(dá)77-87
• 5.1 材料與方法78-83
• 5.1.1 供試綠盲蝽及飼養(yǎng)方法78
• 5.1.2 試劑78
• 5.1.3 試劑的配制78-79
• 5.1.4 儀器79
• 5.1.5 總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成79
• 5.1.6 引物的設(shè)計(jì)79
• 5.1.7 重組質(zhì)粒的構(gòu)建79-80
• 5.1.8 Bacmid重組質(zhì)粒的提取80-81
• 5.1.9 Bacmid重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞81
• 5.1.10 病毒滴度測定(空斑法)81-82
• 5.1.11 Western Blot檢測82
• 5.1.12 P450酶活性測定82-83
• 5.1.13 7-羥基香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作83
• 5.1.14 蛋白含量測定83
• 5.2 結(jié)果83-86
• 5.2.1 Bacmid-CYP6X2與Bacmid-CPR重組質(zhì)粒的構(gòu)建83-85
• 5.2.2 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體異源表達(dá)CYP6B6重組蛋白85-86
• 5.3 討論86-87
• 第六章 綠盲蝽CYP6X2基因的啟動子87-97
• 6.1 材料與方法87-91
• 6.1.1 供試綠盲蝽及飼養(yǎng)方法87
• 6.1.2 試劑87-88
• 6.1.3 主要儀器88
• 6.1.4 啟動子克隆引物的設(shè)計(jì)88
• 6.1.5 染色體步移法克隆啟動子88-90
• 6.1.6 啟動子報(bào)告基因載體的構(gòu)建90-91
• 6.1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染91
• 6.1.8 啟動子活性測定91
• 6.2 結(jié)果與分析91-95
• 6.2.1 CYP6X2基因啟動子的克隆91-94
• 6.2.2 CYP6X2基因5’側(cè)翼序列報(bào)告基因載體的構(gòu)建94-95
• 6.2.3 CYP6X2基因5’側(cè)翼序列不同長度片段啟動子活性95
• 6.3 討論95-97
• 第七章 山東濱州地區(qū)的綠盲蝽種群對高效氯氟氰菊酯菊酯的抗性機(jī)制97-102
• 7.1 材料與方法97-99
• 7.1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)97
• 7.1.2 化學(xué)試劑97
• 7.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器97
• 7.1.4 羧酸酯酶活性的測定97-98
• 7.1.5 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GSTs活性的測定98
• 7.1.6 P450酶活性測定98
• 7.1.7 鈉離子通道基因點(diǎn)突變的檢測98-99
• 7.1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析99
• 7.2 結(jié)果分析99-101
• 7.2.1 三種解毒代謝酶的活性比較99-100
• 7.2.2 鈉離子通道基因的氨基酸比較100
• 7.2.3 山東濱州地區(qū)L1015F點(diǎn)突變頻率的檢測100-101
• 7.3 討論101-102
• 第八章 河北滄州綠盲蝽種群對毒死蜱的抗性機(jī)制102-111
• 8.1 材料與方法102-104
• 8.1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)102
• 8.1.2 化學(xué)試劑與儀器102
• 8.1.3 解毒代謝酶活性的測定102
• 8.1.4 乙酰膽堿酯酶活性抑制實(shí)驗(yàn)102-103
• 8.1.5 乙酰膽堿酯酶的克隆及序列對比103-104
• 8.1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析104
• 8.2 結(jié)果分析104-109
• 8.2.1 河北滄州地區(qū)種群對有機(jī)磷殺蟲劑的敏感性104
• 8.2.2 河北滄州種群與敏感品系的解毒代謝酶活性比較104-105
• 8.2.3 氧化毒死蜱對河北滄州種群的乙酰膽堿酯酶抑制105
• 8.2.4 綠盲蝽乙酰膽堿酯酶基因的克隆105-107
• 8.2.5 綠盲蝽乙酰膽堿酯酶的系統(tǒng)進(jìn)化分析107-109
• 8.2.6 河北滄州種群AlAChEl中點(diǎn)突變Ala216Ser的檢測109
• 8.3 討論109-111
• 總結(jié)與展望111-112
• 參考文獻(xiàn)112-132
• 致謝132-133
• 作者簡介133

  本文關(guān)鍵詞：綠盲蝽對常用殺蟲藥劑的抗藥性監(jiān)測及其抗藥性機(jī)制分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：488674