本文關(guān)鍵詞：黃瓜耐冷生理變化規(guī)律及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組測序和表達(dá)分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：溫度是植物自然地理分布和產(chǎn)量形成的主要限制因素,同時(shí)也是作物生長發(fā)育的必要條件之一。黃瓜(Cucumis sativus.L.)屬喜溫作物,對溫度反應(yīng)敏感,耐寒力弱,是我國設(shè)施栽培及露地生產(chǎn)中重要的蔬菜種類之一。但是在實(shí)際的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,經(jīng)常會(huì)發(fā)生低溫冷害,導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn),給廣大農(nóng)戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中及極其嚴(yán)重的自然災(zāi)害,在黑龍江省低溫冷害現(xiàn)象表現(xiàn)的更為突出。本研究以黃瓜幼苗為試材,以6℃為低溫脅迫條件,采用冷害指數(shù)調(diào)查、生理生化指標(biāo)的測定、轉(zhuǎn)錄組測序、差異基因GO分析、pathway分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及RNAi等技術(shù)試圖從生理和分子水平研究植物的低溫脅迫反應(yīng)的生理機(jī)制,旨在為提高黃瓜的耐冷栽培、促進(jìn)植物耐冷基因工程的進(jìn)展、通過分子手段研究植物關(guān)鍵基因的調(diào)控及提高耐冷性奠定基礎(chǔ),同時(shí)也為黃瓜育種和耐冷栽培提供一定的生理生化和分子理論基礎(chǔ)。通過冷害指數(shù)調(diào)查對搜集的20個(gè)黃瓜自交系進(jìn)行耐冷性鑒定,獲得耐冷自交系6個(gè),冷敏自交系5個(gè),耐冷中間型自交系9個(gè)。明確黃瓜的耐冷性與黃瓜品種的類型無明顯關(guān)系。低溫脅迫后黃瓜的生理生化代謝發(fā)生變化,相對電導(dǎo)率、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖、可溶性蛋白,脯氨酸、丙二醛的含量升高,葉綠素含量降低,超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性增強(qiáng)。以冷害指數(shù)為依據(jù),確定了黃瓜耐冷相關(guān)生理生化指標(biāo)。相對電導(dǎo)率增量可以作為耐冷指標(biāo),14.36以下的可認(rèn)定為耐冷型黃瓜,25.67以上的可認(rèn)定為冷敏型黃瓜。丙二醛含量增量和增幅都可以作為耐冷指標(biāo),4.17、166.14%以下的可認(rèn)定為耐冷型黃瓜,5.98、223.97%以上的可認(rèn)定為冷敏型黃瓜。脯氨酸含量增量可以作為耐冷指標(biāo),54.00以上的可認(rèn)定為耐冷型黃瓜,45.00以下的可認(rèn)定為冷敏型黃瓜�？扇苄蕴呛吭隽靠梢宰鳛槟屠渲笜�(biāo),1.09以上的可認(rèn)定為耐冷型黃瓜,0.63以下的可認(rèn)定為冷敏型黃瓜�？扇苄缘鞍缀吭隽靠梢宰鳛槟屠渲笜�(biāo),20.38以上的可認(rèn)定為耐冷型黃瓜,14.90以下的可認(rèn)定為冷敏型黃瓜。葉綠素含量降量和降幅都可以作為耐冷指標(biāo),0.48、36.36%以下的可認(rèn)定為耐冷型黃瓜,0.87、69.23%以上的可認(rèn)定為冷敏型黃瓜。超氧化物歧化酶活性增量和增幅都可以作為耐冷指標(biāo),21.56、141.75%以上的可認(rèn)定為耐冷型黃瓜,13.92、59.05%以下的可認(rèn)定為冷敏型黃瓜。過氧化物酶活性增量和增幅都可以作為耐冷指標(biāo),73、73.74%以上的可認(rèn)定為耐冷型黃瓜,16、16.84%以下的可認(rèn)定為冷敏型黃瓜。過氧化氫酶活性增量可以作為耐冷指標(biāo),12.85以上的可認(rèn)定為耐冷型黃瓜,9.66以下的可認(rèn)定為冷敏型黃瓜。同時(shí)獲得生理生化指標(biāo)的相關(guān)性,冷害指數(shù)與相對電導(dǎo)率和丙二醛含量呈顯著性正相關(guān),與脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、葉綠素含量、SOD活性、POD活性和CAT活性呈顯著性負(fù)相關(guān)。以鑒定獲得的耐冷型黃瓜自交系A(chǔ)和冷敏型黃瓜自交系D及經(jīng)過6℃低溫處理后的A1、D1為材料,通過轉(zhuǎn)錄組測序,材料A獲得14302個(gè)基因,材料A1獲得15032個(gè)基因,材料D獲得14843個(gè)基因,材料D1獲得14993個(gè)基因。通過差異基因比對獲得A-VS-A1的上調(diào)表達(dá)基因3353個(gè)、下調(diào)表達(dá)基因1629個(gè),D-VS-D1的上調(diào)表達(dá)基因886個(gè)、下調(diào)表達(dá)基因262個(gè)。材料A發(fā)現(xiàn)了1300個(gè)新轉(zhuǎn)錄本,材料A1發(fā)現(xiàn)了1253個(gè)新轉(zhuǎn)錄本,材料D發(fā)現(xiàn)了1264個(gè)新轉(zhuǎn)錄本,材料D1發(fā)現(xiàn)了1213個(gè)新轉(zhuǎn)錄本。從實(shí)驗(yàn)材料獲得了可變剪接,材料A的可變剪接數(shù)為43716個(gè)、材料A1為49134個(gè)、材料D為38223個(gè)、材料D1為48501個(gè)。通過一致性序列與參考序列的比較,從而找到SNPs,材料A為36539、A1為37004、D為32967、D1為39189。通過GO功能顯著性富集分析確定在A-VS-A1 Cellular component中,最富集的是non-membrane-bounded organelle,共有288個(gè)基因;molecular function中最富集的是hydrolase activity,共有107個(gè)基因;biological process中最富集的是DNA replication initiation,共有20個(gè)基因。在D-VS-D1 Cellular component中,最富集的是external encapsulating structure,共有20個(gè)基因;molecular function中最富集的是oxidoreductase activity,共有8個(gè)基因;biological process中最富集的是response to chemical,共有133個(gè)基因。同時(shí)在耐冷材料中發(fā)現(xiàn)了376個(gè)在冷敏材料中無差異表達(dá)的基因,其中上調(diào)表達(dá)基因167個(gè)、下調(diào)表達(dá)基因209個(gè)。通過對代謝通路分析,在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,耐冷材料有278個(gè)差異表達(dá)基因,冷敏材料有83個(gè)差異表達(dá)基因。在植物病原菌互作通路中,耐冷材料有241個(gè)差異表達(dá)基因,冷敏材料有58個(gè)差異基因。在卟啉和葉綠素代謝通路中,耐冷材料有17個(gè)差異表達(dá)基因,冷敏材料有3個(gè)差異基因。在過氧化物酶體代謝通路中,耐冷材料有20個(gè)差異表達(dá)基因,冷敏材料有2個(gè)差異基因。在脂肪酸代謝通路中,耐冷材料有6個(gè)差異表達(dá)基因,冷敏材料沒有這個(gè)代謝通路。在光合作用代謝通路中,耐冷材料有7個(gè)差異表達(dá)基因,冷敏材料沒有差異基因表達(dá)。在精氨酸和脯氨酸代謝通路中,耐冷材料有28個(gè)差異表達(dá)基因,冷敏材料有4個(gè)差異基因。在自噬調(diào)節(jié)代謝通路中,耐冷材料有15個(gè)差異表達(dá)基因,冷敏材料有9個(gè)差異基因。而且把差異表達(dá)基因都定位在了蛋白和酶處,并獲得了所有差異表達(dá)基因的全長序列。通過對上調(diào)表達(dá)基因Cucsa.038100.1和下調(diào)表達(dá)Cucsa.178120.1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR,確定在A材料中基因Cucsa.038100.1表達(dá)最好,處理前表達(dá)量比較高,處理后開始降低再升高,在處理4小時(shí)最高,然后降低再升高�；駽ucsa.178120.1處理前在材料D中表達(dá)最好,然后降低再升高,但是在處理4小時(shí)在A材料中最高,然后降低再升高,在12小時(shí)達(dá)到另一個(gè)峰值。通過比對分析明確上調(diào)表達(dá)基因起主要作用。
【關(guān)鍵詞】：黃瓜 生理生化指標(biāo) 轉(zhuǎn)錄組測序 代謝通路分析 表達(dá)分析
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S642.2
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 1 前言13-31
• 1.1 研究的目的和意義13-14
• 1.2 研究內(nèi)容和技術(shù)路線14-15
• 1.2.1 研究內(nèi)容14-15
• 1.2.2 研究技術(shù)路線15
• 1.3 國內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)與趨勢15-31
• 1.3.1 植物的表達(dá)系統(tǒng)和耐冷性16-22
• 1.3.2 植物耐冷基因的研究進(jìn)展22-24
• 1.3.3 轉(zhuǎn)錄組測序24-26
• 1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR26-27
• 1.3.5 比較基因組學(xué)27
• 1.3.6 RNA干擾技術(shù)的研究進(jìn)展27-31
• 2 材料與方法31-41
• 2.1 黃瓜自交系的收集及耐冷性鑒定31-33
• 2.1.1 試驗(yàn)材料31
• 2.1.2 試驗(yàn)方法31-33
• 2.2 不同黃瓜自交系低溫處理后轉(zhuǎn)錄組文庫制備33-37
• 2.2.1 試驗(yàn)材料33-34
• 2.2.2 試驗(yàn)方法34-37
• 2.3 黃瓜基因組中耐冷相關(guān)基因組織表達(dá)特異性分析37-40
• 2.3.1 試驗(yàn)材料37
• 2.3.2 處理方法37
• 2.3.3 主要儀器設(shè)備37-38
• 2.3.4 PCR引物設(shè)計(jì)與合成38
• 2.3.5 總RNA的提取38
• 2.3.6 c DNA鏈合成38
• 2.3.7 反轉(zhuǎn)錄38-39
• 2.3.8 熒光定量PCR39-40
• 2.4 利用RNAi驗(yàn)證候選基因在黃瓜耐冷中的功能40
• 2.4.1 ds RNA干擾載體的構(gòu)建40
• 2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析40-41
• 3 結(jié)果與分析41-89
• 3.1 黃瓜自交系耐冷性鑒定41-52
• 3.1.1 利用冷害指數(shù)調(diào)查的方法對黃瓜自交系的耐冷性鑒定41
• 3.1.2 不同耐冷性黃瓜自交系的生理生化指標(biāo)變化規(guī)律41-52
• 3.2 不同黃瓜自交系低溫處理后基因表達(dá)譜差異分析52-86
• 3.2.1 Solexa測序結(jié)果評估52-57
• 3.2.2 獲得的測序結(jié)果與分析57-86
• 3.3 黃瓜基因組中耐冷基因組織表達(dá)特異性分析86-89
• 3.3.1 熒光定量PCR曲線86-87
• 3.3.2 特異性表達(dá)分析87-89
• 4 討論89-94
• 4.1 黃瓜冷害與鑒定方法89-90
• 4.2 基因克隆技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組測序90-91
• 4.3 黃瓜基因功能驗(yàn)證與生理生化指標(biāo)91
• 4.4 黃瓜低溫處理后代謝通路和冷害調(diào)控的關(guān)系91-92
• 4.5 耐冷相關(guān)基因的表達(dá)92-93
• 4.6 本論文的創(chuàng)新之處93
• 4.7 下一步工作設(shè)想93-94
• 5 結(jié)論94-96
• 致謝96-97
• 參考文獻(xiàn)97-116
• 附錄116-127
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文127

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 馬麗;張春慶;;RNA干擾機(jī)制及應(yīng)用研究進(jìn)展[J];北方園藝;2012年10期

2 康俊梅;李燕;沈靜;熊軍波;楊青川;;低溫脅迫對野牛草幼苗滲透調(diào)節(jié)物與根系活力的影響[J];中國畜牧獸醫(yī);2010年12期

3 楊帆;黃立華;張愛兵;;高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)及其在鱗翅目昆蟲上的應(yīng)用[J];昆蟲學(xué)報(bào);2014年08期

4 冷鸝;Q美

本文編號(hào)：471095