發(fā)布時間：2017-06-23 02:08

  本文關(guān)鍵詞：紅麻UG93A和UG93B線粒體基因組差異分析及CMS相關(guān)基因的發(fā)掘，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：植物細胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)系是雜交種子生產(chǎn)的基礎(chǔ),也是研究核質(zhì)互作關(guān)系的良好材料,其分子機理研究長期以來是國內(nèi)外研究的熱點和難點。紅麻(Hibiscus cannabinus L.)是一年生韌皮纖維植物,是重要的麻紡和造紙原料。因其以收獲莖稈和韌皮纖維為主要生產(chǎn)目的,紅麻易獲得營養(yǎng)體生長優(yōu)勢,其雜種優(yōu)勢利用對紅麻育種家具有極大的誘惑力。廣西大學(xué)周瑞陽教授的創(chuàng)新團隊于2001年3月在海南冬繁的紅麻野生種UG93中發(fā)現(xiàn)了1株雄性不育株,以此為細胞質(zhì)供體,已選育出7個紅麻CMS系,組配出了4個紅優(yōu)系列三系雜交種,我國紅麻雜種優(yōu)勢的利用居國際領(lǐng)先水平。研究發(fā)現(xiàn),紅麻UG93群體中大部分可育株系可以保持UG93雄性不育株的CMS特性,以此可育株系為細胞核供體,已選育出了UG93A及其保持系UG93B(UG93中具有保持CMS特性的可育株系)。由于二者源于同一品種群體,推測UG93A是UG93B的CMS突變型,UG93B是其野生型。因其為細胞質(zhì)近等基因系,為研究紅麻CMS的分子機理提供了及有價值的研究材料。本研究以紅麻CMS系UG93A,保持系UG93B和UG93A/992(恢復(fù)系)雜交F1為材料,通過高通量測序、Northern Blot等方法從基因組水平和RNA表水平研究了紅麻不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)的線粒體基因組結(jié)構(gòu)差異和轉(zhuǎn)錄本差異,得到以下主要結(jié)論：1利用SMRT測序技術(shù)對紅麻UG93B線粒體全基因組進行高通量測序,將原始數(shù)據(jù)過濾和接頭去除后,得到67,152條reads，平均長度為5.4k,最長的read達到32kb,測序深度達605×。以長的reads做為種子序列,將短序列比對到長的種子序列,以提高長序列堿基的準(zhǔn)確度,得到高質(zhì)量的長reads 12.1Mb,平均長度為6.7kb,質(zhì)量值高達Q59。2將過濾后紅麻線粒體測序數(shù)據(jù)進行組裝,得到紅麻線粒體全基因組是一個序列長度為569,912bp, GC含量為44.9%的環(huán)狀DNA分子,并繪制了紅麻線粒體完成圖譜。通過注釋軟件對紅麻線粒體基因進行注釋,得出紅麻線粒體基因組中共有59個線粒體基因,其中包括36個是蛋白編碼基因,3個rRNA基因和20種tRNA基因,這些線粒體序列占總線粒體基因組序列的7.1%,同時預(yù)測到375個序列長度大于100bp的orfs,這一部分序列占紅麻線總粒體基因組的26%。3紅麻UG93B線粒體基因組中總共有50個大小從65-7782bp的重復(fù)序列,占總線粒體基因組序列的3.4%。這些重復(fù)序列主要以大于100bp重復(fù)的序列為主,共有28個,而大于lkb以上的重復(fù)序列只有3個。在這些大片段(=100bp)的重復(fù)序列中,除了有3個重復(fù)片段有3個拷貝以外,其他的絕大多數(shù)以兩個拷貝為主,紅麻UG93B基因組中,重復(fù)序列以正向重復(fù)和回文重復(fù)為主。4將紅麻UG93A線粒體基因組重測序序列與參考序列UG93B線粒體基因組比對,共找到398個SNPs和230個InDels變異位點,其中有362個SNPs分布在基因間或內(nèi)含子上,占總SNPs變異位點的90%,只有36個SNPs分布在線粒體基因的編碼區(qū),占總SNPs的10%。其中有15個SNPs在基因編碼區(qū)發(fā)生同義突變,導(dǎo)致6個線粒體基因的氨基殘基組成發(fā)生變化。在230個InDels變異位點中,以小片段的InDels為主(1-5bp),占InDel總數(shù)的77.4%。而6-31bp的InDe只占總InDel的22.6%。而且絕大多數(shù)的InDels位點分布在基因間隔區(qū)間和內(nèi)含子區(qū),僅有11個InDels(占4.8%)分布在基因的編碼區(qū)。5 利用Northern Blot技術(shù)檢測了36個紅麻蛋白編碼的線粒體基因在UG93A. UG93B和F1 (UG93A/992)之間mRNA轉(zhuǎn)錄表達的差異,其中只有6個線粒體基因的轉(zhuǎn)錄本在不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)之間存在差異,它們分別是atp1、atp4、atp6、atp9、 cox3和sdh4,其中,除了atp9以外,其他5個基因的轉(zhuǎn)錄本雖然在不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)之間有差異,但F1 (UG93A/992)的轉(zhuǎn)錄本與UG93A的轉(zhuǎn)錄本完全相同,說明這幾個線粒體基因與紅麻CMS沒有直接的關(guān)系。6在atp9的轉(zhuǎn)錄本中,UG93A的轉(zhuǎn)錄本小于UG93B和F1(P3A/992)代,雖然UG93A和F1(P3A/992)胞質(zhì)相同,由于F1(UG93A/992)中有核恢復(fù)基因,影響了atp9在F1(UG93A/992)的表達,進一步推測atp9有可能與紅麻CMS有著密切的關(guān)系。7紅麻atp8基因長度為480bp,編碼159個氨基酸殘基,而且在其3’側(cè)翼序列中不育系UG93A比UG93B多9bp插入,用反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)比較兩個材料之間RNA編輯的差異,結(jié)果表明,在UG93A中,atp8基因有5個位點發(fā)生了RNA編輯,而UG93B中存在6個RNA編輯位點,而且不育系中RNA編輯頻率高于保持系。在不育系、保持系和F1 (UG93A/992)之間對atp8進行相對熒光定量表達差異分析,得出atp8在UG93A中相對表達量顯著低于UG93B和F1(UG93A/992)。而且,基于atp8 3’側(cè)翼序列不育系UG93A比UG93B多9 bp插入這一特征,開發(fā)了一個與紅麻雄性不育相關(guān)的分子標(biāo)記,并用于檢測與紅麻不育胞質(zhì)相關(guān)的種質(zhì)資源。
【關(guān)鍵詞】：紅麻 UG93A UG93B 線粒體基因組 CMS
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S563.5
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 縮略詞10-14
• 1 前言14-36
• 1.1 高等植物與CMS14
• 1.2 高等植物CMS研究的相關(guān)策略14-15
• 1.3 單分子實時測序技術(shù)在基因組研究中的應(yīng)用15-18
• 1.3.1 實時單分子測序技術(shù)的原理16-17
• 1.3.2 SMRT測序的特點17
• 1.3.3 SMRT測序技術(shù)的應(yīng)用17-18
• 1.4 高等植物線粒體與CMS18-34
• 1.4.1 高等植物線粒體基因組的研究18-19
• 1.4.2 高等植物線粒體基因的結(jié)構(gòu)19-23
• 1.4.3 高等植物線粒體基因的組成23
• 1.4.4 高等植物線粒體與CMS23-30
• 1.4.5 高等植物CMS作用的分子機制30-32
• 1.4.6 高等植物CMS育性恢復(fù)研究32-34
• 1.5 紅麻細胞CMS機理研究進展34-35
• 1.6 本研究的目的意義35-36
• 2 紅麻UG93B線粒體全基因組測序和完成圖構(gòu)建36-57
• 2.1 材料與方法36-45
• 2.1.1 研究材料36
• 2.1.2 儀器和試劑36-39
• 2.1.3 紅麻線粒體DNA(mtDNA)的提取39-41
• 2.1.4 紅麻UG93B線粒體全基因組文庫的構(gòu)建與測序41
• 2.1.5 紅麻UG93B線粒體基因組數(shù)據(jù)的預(yù)處理41-42
• 2.1.6 紅麻UG93B線粒體全基因組的序列組裝42-44
• 2.1.7 紅麻UG93B線粒體全基因組基因注釋及功能分析44
• 2.1.8 紅麻UG93B線粒體基因組重復(fù)序列預(yù)測44-45
• 2.2 結(jié)果與分析45-55
• 2.2.1 紅麻UG93B mtDNA提取結(jié)果和mtDNA樣品質(zhì)量檢測45-46
• 2.2.2 紅麻UG93B線粒體基因組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計和質(zhì)量分析46-48
• 2.2.3 紅麻UG93B線粒體DNA的序列組裝48-50
• 2.2.4 紅麻UG93B線粒體DNA的基因預(yù)測和功能分析50-52
• 2.2.5 紅麻UG93B線粒體DNA的重復(fù)序列分析52-55
• 2.3 討論55-57
• 2.3.1 紅麻線粒體全基因組測序55
• 2.3.2 紅麻線粒體基因組的基因分析55-57
• 3 紅麻UG93A線粒體基因組重測序及其序列分析57-66
• 3.1 材料與方法57-59
• 3.1.1 研究材料57
• 3.1.2 儀器和試劑57-58
• 3.1.3 研究方法58
• 3.1.4 紅麻UG93A線粒體DNA的提取和質(zhì)量鑒定58
• 3.1.5 紅麻UG93A線粒體基因組文庫構(gòu)建與重測序58-59
• 3.1.6 重測序數(shù)據(jù)的比較基因組分析59
• 3.2 結(jié)果與分析59-64
• 3.2.1 紅麻UG93A線粒體基因組的提取和質(zhì)量檢測59
• 3.2.2 紅麻UG93A線粒體重測序的生物信息學(xué)分析59-64
• 3.3 討論64-66
• 3.3.1 紅麻UG93A線粒體基因組的變異特點64
• 3.3.2 紅麻UG93A線粒體基因組的結(jié)構(gòu)特點64-66
• 4 紅麻線粒體基因轉(zhuǎn)錄本研究66-79
• 4.1 材料和方法66-75
• 4.1.1 研究材料66
• 4.1.2 主要的實驗儀器和試劑66-67
• 4.1.3 Northern Blot探針引物序列設(shè)計與合成67-68
• 4.1.4 Northern Blot探針的制備68-69
• 4.1.5 紅麻總花藥RNA的提取69
• 4.1.6 紅麻線粒體基因Northern Blot分析69-75
• 4.2 結(jié)果與分析75-77
• 4.2.1 紅麻花藥總RNA的提取75
• 4.2.2 紅麻線粒體基因轉(zhuǎn)錄本表達分析75-77
• 4.3 討論77-79
• 4.3.1 線粒體全基因組比較研究的基本策略77
• 4.3.2 不同胞質(zhì)中紅麻線粒體基因的差異表達77-78
• 4.3.3 與紅麻CMS相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄特征78-79
• 5 紅麻不同胞質(zhì)atp8基因的比較分析及細胞質(zhì)雄性不育分子標(biāo)記的開發(fā)79-99
• 5.1 材料和方法79-91
• 5.1.1 研究材料79
• 5.1.2 主要儀器和試劑79-81
• 5.1.3 紅麻總DNA的提取81-82
• 5.1.4 紅麻花藥總RNA的提取82-83
• 5.1.5 cDNA的合成83-84
• 5.1.6 基因的擴X，
  
  本文編號：473674
  boshi