本文關(guān)鍵詞：中國甘薯雙生病毒種類鑒定、分子變異及檢測方法研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甘薯是我國重要的糧食作物、食品加工和工業(yè)原料及有潛力的能源作物。我國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國。近年來甘薯雙生病毒病在我國的發(fā)生危害日益加重,嚴(yán)重影響甘薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。由于我國甘薯雙生病毒病一直缺乏系統(tǒng)研究,甘薯雙生病毒的種類、分布、分子變異及致病性尚不清楚,導(dǎo)致對這一病害的防控缺乏科學(xué)依據(jù)。針對上述問題開展了相關(guān)研究,取得主要結(jié)果如下： 1)中國甘暮雙生病毒的種類、發(fā)生頻率及分布：利用PCR和RCA方法對采自全國20多個省(市)的約330份甘薯樣品進(jìn)行了雙生病毒的檢測。共獲得51個甘薯雙生病毒基因組(近)全長序列。我國甘薯雙生病毒有9個種,包括甘薯曲葉病毒(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV)、甘薯中國曲葉病毒(Sweet potato leaf curl China virus, SPLCCNV)、甘薯喬治亞曲葉病毒(Sweet potato leaf curl Geogia virus, SPLCGoV)3個種,甘薯上海曲葉病毒(Sweet potato leaf curl Shanghai virus, SPLCShV)和甘薯日本曲葉病毒(Sweet potato leaf curl Japan virus, SPLCJV)2個暫定種,以及甘薯中國四川曲葉病毒(Sweet potato leaf curl China Sichuan virus, SPLCCS)、甘薯河南曲葉病毒Sweet potato leaf curl Henan virus (SPLCHnV)、甘薯廣西曲葉病毒(Sweet potato leaf curl Guangxi virus, SPLCGxV)和甘薯河南4曲葉病毒(Sweet potato leaf curl Henan4virus, SPLCHn4V)4個新種。SPLCV的發(fā)生頻率最高,達(dá)37.3%；其次為SPLCShV (17.6%), SPLCHn4V和SPLCCNV發(fā)生頻率分別為11.8%和2.0%,相對較低。甘薯雙生病毒在我國三大薯區(qū)均有分布,54.9%的陽性樣品表現(xiàn)出卷葉癥狀。 2)中國甘暮雙生病毒的分子變異：中國甘薯雙生病毒51個不同分離物的基因組核酸序列相似性在78.6%-99.9%之間。SPLCV19個分離物核酸序列相似性在91.3%-99.9%之間,種內(nèi)變異最大；SPLCJV7個分離物的核酸序列相似性在98.7%-99.8%之間,種內(nèi)變異相對較小。進(jìn)化樹分析顯示中國甘薯雙生病毒可分為9個分支。中國甘薯雙生病毒64個CP基因的核酸序列相似性在84.5%-100%之間,在進(jìn)化樹上聚為兩個大的分支。 3)甘暮雙生病毒4個新種的全序列及重組分析：獲得了4個甘薯雙生病毒新種的基因組全長序列。SPLCCSV基因組全長2764nts,與SPLCCNV的核酸序列相似性最高(84.8%)；重組分析發(fā)現(xiàn)SPLCCSV含有由SPLCV-GZ01和SPLCV-Merremia N4重組而來的序列。SPLCHnV基因組全長2766nts,與SPLCCSV的核酸序列相似性最高(89.0%),其AC2、 AC3基因是由SPLCCNV-[CN:05]與SPLCV-CE[BR:Forl]重組而來,非編碼區(qū)(IR區(qū))含有SPLCBeV和SPLCCNV-ZJ重組而來的序列。SPLCGxV基因組全長2831nts,與SPLCCSV核酸序列相似性最高(88.3%)；它含有由SPLCCNV-[Sichuan14:2012]與SPLCShV重組而來的序列。SPLCHn4V基因組全長2826nts,與SPLCCNV核酸序列相似性最高(89.7%),含有由SPLCV-J508, SPLCV-[Guangxi2:2012]和SPLCV重組而來的序列。 4)甘暮雙生病毒的檢測方法研究： ①SPLCCSV和SPLCV CP基因的原核表達(dá)及抗血清制備；在大腸桿菌中高效表達(dá)了SPLCCSV和SPLCV的CP基因,以表達(dá)的蛋白為抗原免疫家兔,制備了SPLCCSV和SPLCV兩種病毒的特異性抗血清。ACP-ELISA檢測結(jié)果表明,SPLCCSV抗血清的效價為1:5000,SPLCV抗血清效價為1：2000。兩種抗血清均可用于田間甘薯樣品的檢測。 ②多重PCR檢測方法的建立：通過設(shè)計針對SPLCV、 SPLCGoV和SPLCHn4V三種雙生病毒的特異性引物,優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件,建立了能同時檢測這三種甘薯雙生病毒的多重PCR方法。該方法能有效區(qū)分三種病毒,最低檢測拷貝數(shù)分別為2.46×104拷貝/μL、1.47×104拷貝/μL和1.58×104拷貝/μL。 ③基于深度測序技術(shù)的甘暮雙生病毒檢測方法：首次將深度測序技術(shù)應(yīng)用于甘薯雙生病毒的檢測,通過提取甘薯樣品的總DNA,經(jīng)RCA、構(gòu)建DNA文庫、高通量測序、數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、病毒片段拼接比對及PCR驗證,共檢測到7種甘薯雙生病毒。 5) SPLCCSV侵染性克隆的構(gòu)建：利用無縫連接技術(shù)構(gòu)建了SPLCCSV的侵染性克隆。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法接種病毒3周后,本氏煙系統(tǒng)葉出現(xiàn)輕微的皺縮、起泡和黃化癥狀,利用PCR方法從本氏煙的系統(tǒng)葉中檢測到了SPLCCSV的存在,初步證明了侵染性克隆SPLCCSV的活性。
【關(guān)鍵詞】：甘薯雙生病毒 種類鑒定 變異 檢測方法 侵染性克隆
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S435.31
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-25
• 1.1 雙生病毒簡介11-22
• 1.1.1 雙生病毒的發(fā)生與危害11-12
• 1.1.2 雙生病毒的分類與命名規(guī)則12-16
• 1.1.3 雙生病毒的變異16-18
• 1.1.4 雙生病毒的檢測方法18-21
• 1.1.5 雙生病毒侵染性克隆的構(gòu)建21-22
• 1.2 甘薯雙生病毒研究進(jìn)展22-24
• 1.2.1 甘薯的重要地位及產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀22
• 1.2.2 甘薯雙生病毒的發(fā)生與危害22-23
• 1.2.3 甘薯雙生病毒的種類和變異23-24
• 1.3 本研究的目的和意義24-25
• 1.3.1 我國甘薯雙生病毒病研究有待深入探究的問題24
• 1.3.2 本研究的目的和意義24-25
• 第二章 中國甘薯雙生病毒的種類、發(fā)生頻率及分布25-40
• 2.1 試驗材料25-26
• 2.1.1 供試甘薯樣品25
• 2.1.2 菌株和載體25
• 2.1.3 試劑(盒)和酶25
• 2.1.4 引物25-26
• 2.2 試驗方法26-29
• 2.2.1 基本的分子生物學(xué)方法26-28
• 2.2.2 甘薯雙生病毒的PCR檢測28
• 2.2.3 DNA β的檢測28
• 2.2.4 DNA-B組份的檢測28
• 2.2.5 甘薯雙生病毒的RCA檢測28-29
• 2.2.6 序列分析方法29
• 2.2.7 病毒分布及發(fā)生頻率統(tǒng)計29
• 2.3 結(jié)果與分析29-38
• 2.3.1 中國甘薯雙生病毒的種類29-32
• 2.3.2 中國甘薯雙生病毒的發(fā)生頻率及分布32-33
• 2.3.3 缺陷型干擾DNA分子的克隆和分析33
• 2.3.4 甘薯雙生病毒4個新種的全基因組序列特征33-37
• 2.3.5 與甘薯雙生病毒侵染相關(guān)的癥狀37-38
• 2.4 小結(jié)38-40
• 第三章 中國甘薯雙生病毒的分子變異40-56
• 3.1 試驗材料40-41
• 3.1.1 供試甘薯樣品40
• 3.1.2 試劑(盒)和酶40
• 3.1.3 引物40-41
• 3.2 試驗方法41-42
• 3.2.1 甘薯雙生病毒CP基因的擴(kuò)增41
• 3.2.2 不同甘薯DNA的RCA-RFLP分析41
• 3.2.3 中國甘薯雙生病毒全基因組序列及CP基因的分子變異41-42
• 3.2.4 甘薯雙生病毒4個新種的重組分析42
• 3.3 結(jié)果與分析42-55
• 3.3.1 中國甘薯雙生病毒基因組序列的種間和種內(nèi)變異分析結(jié)果42-46
• 3.3.2 不同甘薯DNA的RCA-RFLP研究結(jié)果46-47
• 3.3.3 中國甘薯雙生病毒CP基因分子變異研究結(jié)果47-50
• 3.3.4 甘薯雙生病毒4個新種的重組分析結(jié)果50-55
• 3.4 小結(jié)55-56
• 第四章 甘薯雙生病毒的檢測方法研究56-76
• 4.1 SPLCCSV和SPLCV CP基因的原核表達(dá)及抗血清制備56-60
• 4.1.1 材料與方法56-57
• 4.1.2 結(jié)果與分析57-60
• 4.2 三種甘薯雙生病毒多重PCR檢測方法的建立60-66
• 4.2.1 材料與方法60-62
• 4.2.2 結(jié)果與分析62-66
• 4.3 基于深度測序技術(shù)的甘薯雙生病毒的檢測與挖掘66-74
• 4.3.1 材料與方法66-68
• 4.3.2 結(jié)果與分析68-74
• 4.4 小結(jié)74-76
• 第五章 SPLCCSV侵染性克隆的構(gòu)建76-81
• 5.1 試驗材料76
• 5.1.1 供試材料和菌株76
• 5.1.2 試劑(盒)和酶76
• 5.2 試驗方法76-78
• 5.2.1 侵染性克隆的構(gòu)建方法76-77
• 5.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒接種77-78
• 5.3 結(jié)果與分析78-80
• 5.3.1 SPLCCSV侵染性克隆的構(gòu)建78-79
• 5.3.2 SPLCCSV侵染性克隆的致病性79-80
• 5.4 小結(jié)80-81
• 第六章 結(jié)論與討論81-87
• 6.1 結(jié)論81-82
• 6.1.1 初步明確了中國甘薯雙生病毒的種類、發(fā)生頻率和分布81
• 6.1.2 明確了中國甘薯雙生病毒的分子變異情況81-82
• 6.1.3 制備了SPLCCSV和SPLCV的特異性抗血清82
• 6.1.4 建立了三種甘薯雙生病毒的多重PCR檢測方法82
• 6.1.5 建立了基于深度測序技術(shù)的甘薯雙生病毒檢測方法82
• 6.1.6 構(gòu)建了SPLCCSV的侵染性克隆82
• 6.2 創(chuàng)新點82
• 6.3 討論與展望82-87
• 6.3.1 甘薯雙生病毒的多樣性82-84
• 6.3.2 甘薯雙生病毒的變異84
• 6.3.3 中國甘薯雙生病毒的檢測方法84-86
• 6.3.4 甘薯雙生病毒侵染性克隆的構(gòu)建86-87
• 參考文獻(xiàn)87-98
• 致謝98-99
• 附錄99-102
• 作者簡介102-103

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 宋紅葉;趙日全;;生物質(zhì)能作物——甘薯開發(fā)利用現(xiàn)狀及趨勢[J];雜糧作物;2006年05期

2 張振臣,馬淮琴,張桂蘭;甘薯病毒病研究進(jìn)展[J];河南農(nóng)業(yè)科學(xué);2000年09期

3 喬貞貞;秦艷紅;喬奇;張德勝;田雨婷;高潔;張振臣;;甘薯卷葉病毒江蘇分離物基因組全長序列測定及其外殼蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)[J];河南農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年04期

4 洪益國,蔡健和,王小鳳,田波;中國南瓜曲葉病毒:一個雙生病毒新種[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1994年06期

5 陳萬祥;楊金龍;;甘薯生產(chǎn)的現(xiàn)狀及開發(fā)利用的途徑[J];農(nóng)業(yè)裝備技術(shù);2008年04期

6 ;Malvastrum yellow vein virus, a new Begomovirus species associated with satellite DNA molecule[J];Chinese Science Bulletin;2003年20期

7 劉慶昌;甘薯在我國糧食和能源安全中的重要作用[J];科技導(dǎo)報;2004年09期

8 謝艷,周雪平,張仲凱,戚益軍;從云南分離的煙草曲頂病毒為菜豆金色花葉病毒屬的一個新種[J];科學(xué)通報;2001年17期

9 馬代夫;李強(qiáng);曹清河;鈕福祥;謝逸萍;唐君;李洪民;;中國甘薯產(chǎn)業(yè)及產(chǎn)業(yè)技術(shù)的發(fā)展與展望[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報;2012年05期

10 錢亞娟;徐毅;周琦;周雪平;;利用深度測序技術(shù)發(fā)掘植物病毒資源[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2014年04期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 楊秀玲;中國番茄黃曲葉病毒抵御RNA沉默的機(jī)制和番茄黃曲葉病毒的分子變異研究[D];浙江大學(xué);2011年

2 李靜;我國六種雙生病毒的分子鑒定及兩種病毒的致病性研究[D];浙江大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：中國甘薯雙生病毒種類鑒定、分子變異及檢測方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：427580