本文關(guān)鍵詞：中國(guó)甘薯雙生病毒種類(lèi)鑒定、分子變異及檢測(cè)方法研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甘薯是我國(guó)重要的糧食作物、食品加工和工業(yè)原料及有潛力的能源作物。我國(guó)是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國(guó)。近年來(lái)甘薯雙生病毒病在我國(guó)的發(fā)生危害日益加重,嚴(yán)重影響甘薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。由于我國(guó)甘薯雙生病毒病一直缺乏系統(tǒng)研究,甘薯雙生病毒的種類(lèi)、分布、分子變異及致病性尚不清楚,導(dǎo)致對(duì)這一病害的防控缺乏科學(xué)依據(jù)。針對(duì)上述問(wèn)題開(kāi)展了相關(guān)研究,取得主要結(jié)果如下： 1)中國(guó)甘暮雙生病毒的種類(lèi)、發(fā)生頻率及分布：利用PCR和RCA方法對(duì)采自全國(guó)20多個(gè)省(市)的約330份甘薯樣品進(jìn)行了雙生病毒的檢測(cè)。共獲得51個(gè)甘薯雙生病毒基因組(近)全長(zhǎng)序列。我國(guó)甘薯雙生病毒有9個(gè)種,包括甘薯曲葉病毒(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV)、甘薯中國(guó)曲葉病毒(Sweet potato leaf curl China virus, SPLCCNV)、甘薯喬治亞曲葉病毒(Sweet potato leaf curl Geogia virus, SPLCGoV)3個(gè)種,甘薯上海曲葉病毒(Sweet potato leaf curl Shanghai virus, SPLCShV)和甘薯日本曲葉病毒(Sweet potato leaf curl Japan virus, SPLCJV)2個(gè)暫定種,以及甘薯中國(guó)四川曲葉病毒(Sweet potato leaf curl China Sichuan virus, SPLCCS)、甘薯河南曲葉病毒Sweet potato leaf curl Henan virus (SPLCHnV)、甘薯廣西曲葉病毒(Sweet potato leaf curl Guangxi virus, SPLCGxV)和甘薯河南4曲葉病毒(Sweet potato leaf curl Henan4virus, SPLCHn4V)4個(gè)新種。SPLCV的發(fā)生頻率最高,達(dá)37.3%；其次為SPLCShV (17.6%), SPLCHn4V和SPLCCNV發(fā)生頻率分別為11.8%和2.0%,相對(duì)較低。甘薯雙生病毒在我國(guó)三大薯區(qū)均有分布,54.9%的陽(yáng)性樣品表現(xiàn)出卷葉癥狀。 2)中國(guó)甘暮雙生病毒的分子變異：中國(guó)甘薯雙生病毒51個(gè)不同分離物的基因組核酸序列相似性在78.6%-99.9%之間。SPLCV19個(gè)分離物核酸序列相似性在91.3%-99.9%之間,種內(nèi)變異最大；SPLCJV7個(gè)分離物的核酸序列相似性在98.7%-99.8%之間,種內(nèi)變異相對(duì)較小。進(jìn)化樹(shù)分析顯示中國(guó)甘薯雙生病毒可分為9個(gè)分支。中國(guó)甘薯雙生病毒64個(gè)CP基因的核酸序列相似性在84.5%-100%之間,在進(jìn)化樹(shù)上聚為兩個(gè)大的分支。 3)甘暮雙生病毒4個(gè)新種的全序列及重組分析：獲得了4個(gè)甘薯雙生病毒新種的基因組全長(zhǎng)序列。SPLCCSV基因組全長(zhǎng)2764nts,與SPLCCNV的核酸序列相似性最高(84.8%)；重組分析發(fā)現(xiàn)SPLCCSV含有由SPLCV-GZ01和SPLCV-Merremia N4重組而來(lái)的序列。SPLCHnV基因組全長(zhǎng)2766nts,與SPLCCSV的核酸序列相似性最高(89.0%),其AC2、 AC3基因是由SPLCCNV-[CN:05]與SPLCV-CE[BR:Forl]重組而來(lái),非編碼區(qū)(IR區(qū))含有SPLCBeV和SPLCCNV-ZJ重組而來(lái)的序列。SPLCGxV基因組全長(zhǎng)2831nts,與SPLCCSV核酸序列相似性最高(88.3%)；它含有由SPLCCNV-[Sichuan14:2012]與SPLCShV重組而來(lái)的序列。SPLCHn4V基因組全長(zhǎng)2826nts,與SPLCCNV核酸序列相似性最高(89.7%),含有由SPLCV-J508, SPLCV-[Guangxi2:2012]和SPLCV重組而來(lái)的序列。 4)甘暮雙生病毒的檢測(cè)方法研究： ①SPLCCSV和SPLCV CP基因的原核表達(dá)及抗血清制備；在大腸桿菌中高效表達(dá)了SPLCCSV和SPLCV的CP基因,以表達(dá)的蛋白為抗原免疫家兔,制備了SPLCCSV和SPLCV兩種病毒的特異性抗血清。ACP-ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,SPLCCSV抗血清的效價(jià)為1:5000,SPLCV抗血清效價(jià)為1：2000。兩種抗血清均可用于田間甘薯樣品的檢測(cè)。 ②多重PCR檢測(cè)方法的建立：通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)SPLCV、 SPLCGoV和SPLCHn4V三種雙生病毒的特異性引物,優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件,建立了能同時(shí)檢測(cè)這三種甘薯雙生病毒的多重PCR方法。該方法能有效區(qū)分三種病毒,最低檢測(cè)拷貝數(shù)分別為2.46×104拷貝/μL、1.47×104拷貝/μL和1.58×104拷貝/μL。 ③基于深度測(cè)序技術(shù)的甘暮雙生病毒檢測(cè)方法：首次將深度測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于甘薯雙生病毒的檢測(cè),通過(guò)提取甘薯樣品的總DNA,經(jīng)RCA、構(gòu)建DNA文庫(kù)、高通量測(cè)序、數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、病毒片段拼接比對(duì)及PCR驗(yàn)證,共檢測(cè)到7種甘薯雙生病毒。 5) SPLCCSV侵染性克隆的構(gòu)建：利用無(wú)縫連接技術(shù)構(gòu)建了SPLCCSV的侵染性克隆。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法接種病毒3周后,本氏煙系統(tǒng)葉出現(xiàn)輕微的皺縮、起泡和黃化癥狀,利用PCR方法從本氏煙的系統(tǒng)葉中檢測(cè)到了SPLCCSV的存在,初步證明了侵染性克隆SPLCCSV的活性。
【關(guān)鍵詞】：甘薯雙生病毒 種類(lèi)鑒定 變異 檢測(cè)方法 侵染性克隆
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S435.31
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-25
• 1.1 雙生病毒簡(jiǎn)介11-22
• 1.1.1 雙生病毒的發(fā)生與危害11-12
• 1.1.2 雙生病毒的分類(lèi)與命名規(guī)則12-16
• 1.1.3 雙生病毒的變異16-18
• 1.1.4 雙生病毒的檢測(cè)方法18-21
• 1.1.5 雙生病毒侵染性克隆的構(gòu)建21-22
• 1.2 甘薯雙生病毒研究進(jìn)展22-24
• 1.2.1 甘薯的重要地位及產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀22
• 1.2.2 甘薯雙生病毒的發(fā)生與危害22-23
• 1.2.3 甘薯雙生病毒的種類(lèi)和變異23-24
• 1.3 本研究的目的和意義24-25
• 1.3.1 我國(guó)甘薯雙生病毒病研究有待深入探究的問(wèn)題24
• 1.3.2 本研究的目的和意義24-25
• 第二章 中國(guó)甘薯雙生病毒的種類(lèi)、發(fā)生頻率及分布25-40
• 2.1 試驗(yàn)材料25-26
• 2.1.1 供試甘薯樣品25
• 2.1.2 菌株和載體25
• 2.1.3 試劑(盒)和酶25
• 2.1.4 引物25-26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-29
• 2.2.1 基本的分子生物學(xué)方法26-28
• 2.2.2 甘薯雙生病毒的PCR檢測(cè)28
• 2.2.3 DNA β的檢測(cè)28
• 2.2.4 DNA-B組份的檢測(cè)28
• 2.2.5 甘薯雙生病毒的RCA檢測(cè)28-29
• 2.2.6 序列分析方法29
• 2.2.7 病毒分布及發(fā)生頻率統(tǒng)計(jì)29
• 2.3 結(jié)果與分析29-38
• 2.3.1 中國(guó)甘薯雙生病毒的種類(lèi)29-32
• 2.3.2 中國(guó)甘薯雙生病毒的發(fā)生頻率及分布32-33
• 2.3.3 缺陷型干擾DNA分子的克隆和分析33
• 2.3.4 甘薯雙生病毒4個(gè)新種的全基因組序列特征33-37
• 2.3.5 與甘薯雙生病毒侵染相關(guān)的癥狀37-38
• 2.4 小結(jié)38-40
• 第三章 中國(guó)甘薯雙生病毒的分子變異40-56
• 3.1 試驗(yàn)材料40-41
• 3.1.1 供試甘薯樣品40
• 3.1.2 試劑(盒)和酶40
• 3.1.3 引物40-41
• 3.2 試驗(yàn)方法41-42
• 3.2.1 甘薯雙生病毒CP基因的擴(kuò)增41
• 3.2.2 不同甘薯DNA的RCA-RFLP分析41
• 3.2.3 中國(guó)甘薯雙生病毒全基因組序列及CP基因的分子變異41-42
• 3.2.4 甘薯雙生病毒4個(gè)新種的重組分析42
• 3.3 結(jié)果與分析42-55
• 3.3.1 中國(guó)甘薯雙生病毒基因組序列的種間和種內(nèi)變異分析結(jié)果42-46
• 3.3.2 不同甘薯DNA的RCA-RFLP研究結(jié)果46-47
• 3.3.3 中國(guó)甘薯雙生病毒CP基因分子變異研究結(jié)果47-50
• 3.3.4 甘薯雙生病毒4個(gè)新種的重組分析結(jié)果50-55
• 3.4 小結(jié)55-56
• 第四章 甘薯雙生病毒的檢測(cè)方法研究56-76
• 4.1 SPLCCSV和SPLCV CP基因的原核表達(dá)及抗血清制備56-60
• 4.1.1 材料與方法56-57
• 4.1.2 結(jié)果與分析57-60
• 4.2 三種甘薯雙生病毒多重PCR檢測(cè)方法的建立60-66
• 4.2.1 材料與方法60-62
• 4.2.2 結(jié)果與分析62-66
• 4.3 基于深度測(cè)序技術(shù)的甘薯雙生病毒的檢測(cè)與挖掘66-74
• 4.3.1 材料與方法66-68
• 4.3.2 結(jié)果與分析68-74
• 4.4 小結(jié)74-76
• 第五章 SPLCCSV侵染性克隆的構(gòu)建76-81
• 5.1 試驗(yàn)材料76
• 5.1.1 供試材料和菌株76
• 5.1.2 試劑(盒)和酶76
• 5.2 試驗(yàn)方法76-78
• 5.2.1 侵染性克隆的構(gòu)建方法76-77
• 5.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒接種77-78
• 5.3 結(jié)果與分析78-80
• 5.3.1 SPLCCSV侵染性克隆的構(gòu)建78-79
• 5.3.2 SPLCCSV侵染性克隆的致病性79-80
• 5.4 小結(jié)80-81
• 第六章 結(jié)論與討論81-87
• 6.1 結(jié)論81-82
• 6.1.1 初步明確了中國(guó)甘薯雙生病毒的種類(lèi)、發(fā)生頻率和分布81
• 6.1.2 明確了中國(guó)甘薯雙生病毒的分子變異情況81-82
• 6.1.3 制備了SPLCCSV和SPLCV的特異性抗血清82
• 6.1.4 建立了三種甘薯雙生病毒的多重PCR檢測(cè)方法82
• 6.1.5 建立了基于深度測(cè)序技術(shù)的甘薯雙生病毒檢測(cè)方法82
• 6.1.6 構(gòu)建了SPLCCSV的侵染性克隆82
• 6.2 創(chuàng)新點(diǎn)82
• 6.3 討論與展望82-87
• 6.3.1 甘薯雙生病毒的多樣性82-84
• 6.3.2 甘薯雙生病毒的變異84
• 6.3.3 中國(guó)甘薯雙生病毒的檢測(cè)方法84-86
• 6.3.4 甘薯雙生病毒侵染性克隆的構(gòu)建86-87
• 參考文獻(xiàn)87-98
• 致謝98-99
• 附錄99-102
• 作者簡(jiǎn)介102-103

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：中國(guó)甘薯雙生病毒種類(lèi)鑒定、分子變異及檢測(cè)方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：427580