發(fā)布時(shí)間：2017-05-29 00:08

  本文關(guān)鍵詞：基于RNA-Seq的蘭州百合鱗莖淀粉-蔗糖代謝關(guān)鍵酶SuSy和INV基因的挖掘，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：淀粉是百合鱗莖中碳水化合物的重要貯藏形式,而蔗糖是百合鱗莖中糖分運(yùn)轉(zhuǎn)的主要形式,淀粉-蔗糖代謝在百合生長發(fā)育中起重要作用。蔗糖在蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, SuSy)和轉(zhuǎn)化酶(Invertase, INV)調(diào)控下參與淀粉的合成,而SuSy和INV基因家族都有多個(gè)成員組成,而在不同植物中不同成員功能也不盡相同。因此,明確百合SuSy和INV的生理作用、基因功能成為進(jìn)一步弄清淀粉合成途徑及小鱗莖形成與發(fā)育機(jī)制的首要任務(wù)。為闡明百合SuSy和INV基因調(diào)控蔗糖進(jìn)入淀粉合成途徑的機(jī)制,本研究在轉(zhuǎn)錄組水平篩選在百合鱗莖發(fā)育過程中差異表達(dá)的SuSy和INV基因,并構(gòu)建其過表達(dá)與RNAi載體。本研究的主要研究結(jié)果如下：1.采用改良CTAB、SDS法與TRIzol法,提取百合鱗莖中的總RNA。結(jié)果表明,SDS法和CTAB法經(jīng)改良后,均可從外、中、內(nèi)層鱗片中提取出電泳條帶清晰、28S條帶亮度約為18S條帶亮度2倍、A260/A280在1.8-2.2之間的總RNA; TRIzol法雖然快捷易操作,但不能有效去除多糖污染。經(jīng)RT-PCR檢驗(yàn),三種方法提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA,TRIzol法擴(kuò)增后無條帶出現(xiàn),SDS法擴(kuò)增得到的條帶亮度較弱,而改良CTAB法能夠擴(kuò)增得到亮度很高的目的條帶,并且CTAB法經(jīng)驗(yàn)證可用于鱗莖不同部位(外層鱗片、中層鱗片、內(nèi)層鱗片、頂芽和鱗莖盤)RNA的提取。2.對(duì)百合小鱗莖形成與發(fā)育過程進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,選取鱗片扦插0 d、15d(小鱗莖出現(xiàn))和35 d(小鱗莖基本形成)三個(gè)階段,最終得到52901個(gè)unigene,平均長度為630 nt,N50為926 nt。對(duì)獲得的unigene進(jìn)行BLAST比對(duì),共有37 385條unigene成功注釋,占轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的70.67%。通過COG比對(duì),有11 150條unigene成功比對(duì),根據(jù)功能分為24類,涉及了大多數(shù)的生命活動(dòng),其中一般功能預(yù)測(cè)(general function prediction only) unigene數(shù)目最多。利用BLAST2GO,最終有26 333條unigene得到注釋,在所有功能分類中,有多個(gè)參與碳水化合物代謝。SSR分析得到1 596個(gè)SSR序列,主要為單堿基重復(fù)。3.選用百合小鱗莖形成與發(fā)育三個(gè)階段轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)比較穩(wěn)定的11個(gè)內(nèi)參基因,其中包括9個(gè)傳統(tǒng)內(nèi)參基因(α-TUB、β-TUB、ACT、elF、GAPDH、UBQ、UBC和60S)和3個(gè)新型候選基因(AP4、FP和RH2),另外選擇在百合qRT-PCR中應(yīng)用較多的18S基因,使用geNorm軟件、Normfinder軟件、Bestkeeper軟件和ACt法評(píng)價(jià)其在不同試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性,最終通過RefFinder軟件進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,在不同組織器官中,ACT、GAPDH和UBQ三個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性最高；在不同發(fā)育過程中,葉片中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因是ACT、AP4和RH2,而鱗片中表達(dá)最穩(wěn)定基因的是GAPDH、ACT和FP；低溫、高溫及鹽脅迫等逆境處理后,FP、UBC和UBQ在葉片中的表達(dá)最穩(wěn)定,ACT, FP和AP4在鱗片中表達(dá)最穩(wěn)定,而AP4、UBC和RH2在根中的表達(dá)要比其他基因穩(wěn)定；在所有樣品中,表達(dá)最穩(wěn)定的基因是FP、AP4和GAPDH。4.利用數(shù)字化表達(dá)譜測(cè)序,在小鱗莖形成與發(fā)育轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基礎(chǔ)上,通過生物學(xué)分析篩選不同樣品中的差異表達(dá)基因,對(duì)其進(jìn)行代謝富集分析,并對(duì)差異表達(dá)的淀粉-蔗糖代謝關(guān)鍵酶的基因表達(dá)模式進(jìn)行分析,探討淀粉-蔗糖代謝在小鱗莖形成與發(fā)育中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),小鱗莖出現(xiàn)階段(15 d)代謝比較活躍,差異表達(dá)基因數(shù)目最多。對(duì)差異表達(dá)基因的GO分析表明,細(xì)胞組分功能中以細(xì)胞(cell)為主,分子功能中大多數(shù)基因富集到催化活性(binding activity),在生物學(xué)過程中代謝過程(metabolic processes)參與的基因最多。代謝通路分析表明,淀粉-蔗糖代謝占主要位置。碳水化合物含量測(cè)定結(jié)果表明,母鱗片中淀粉含量呈下降趨勢(shì),而小鱗莖中淀粉含量呈上升趨勢(shì)；母鱗片中蔗糖含量在小鱗莖出現(xiàn)與形成階段及42 d后急劇下降,而小鱗莖中蔗糖含量在小鱗莖出現(xiàn)與形成階段增加,此后變化幅度較小。小鱗莖出現(xiàn)與形態(tài)建成階段蔗糖降解方向相關(guān)酶(SuSy和INV)在母鱗片中的基因表達(dá)量要高于小鱗莖,而小鱗莖膨大階段則主要在小鱗莖中表達(dá)；蔗糖合成方向相關(guān)酶(SPS)在母鱗片中的基因表達(dá)量呈下降趨勢(shì),而在小鱗莖中的表達(dá)量在形態(tài)建成階段較高。淀粉合成相關(guān)酶在小鱗莖中的表達(dá)豐度要高于母鱗片中的表達(dá)豐度,且以支鏈淀粉合成相關(guān)酶為主；而淀粉分解相關(guān)酶的基因表達(dá)量在母鱗片中較高。5.構(gòu)建在百合小鱗莖形成與發(fā)育過程中差異表達(dá)的SuSy家族基因SuSy1、SuSy2、 SuSy3和INV家族基因SAI的過表達(dá)載體與RNAi載體。最終利用Gateway技術(shù),成功構(gòu)建得到SuSy3的過表達(dá)載體pMDC-SuSy3和RNAi載體pB7WIWG-SuSy3；利用Gibson Assembly技術(shù)成功構(gòu)建得到SuSy1、SuSy2和SAI的過表達(dá)載體pCAMBIA-S1、 pCAMBIA-S2和pCAMBIA-SAI;利用雙酶切法成功構(gòu)建得到SuSy1、SuSy2和SAI的RNAi載體pTCK-S1、pTCK-S2和pTCK-SAI,為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)探討SuSy1、SuSy2、 SuSy3和SAI的功能奠定基礎(chǔ)�？傊�,本研究在RNA-seq基礎(chǔ)上挖掘百合小鱗莖形成與發(fā)育過程中差異表達(dá)的淀粉-蔗糖關(guān)鍵酶SuSy和IN,探討其在小鱗莖發(fā)育不同階段的表達(dá)模式,并構(gòu)建其過表達(dá)與RNAi載體,為明確SuSy和INV的生理作用及基因功能奠定基礎(chǔ),從而為弄清百合鱗莖淀粉合成途徑、生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種球提供依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：蘭州百合 小鱗莖發(fā)育 轉(zhuǎn)錄組 淀粉-蔗糖代謝 載體構(gòu)建
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S682.29
【目錄】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 1. 前言14-34
• 1.1 淀粉-蔗糖代謝關(guān)鍵酶研究進(jìn)展14-21
• 1.1.1 蔗糖的作用及其代謝關(guān)鍵酶14-16
• 1.1.2 SuSy研究進(jìn)展16-19
• 1.1.3 INV研究進(jìn)展19-21
• 1.2 百合總RNA的提取方法及影響因素21-24
• 1.2.1 RNA提取方法概述22-23
• 1.2.2 百合RNA提取23-24
• 1.3 RNA-seq技術(shù)24-30
• 1.3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)概述24-26
• 1.3.2 植物轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究進(jìn)展26-30
• 1.4 內(nèi)參基因的篩選30-32
• 1.4.1 內(nèi)參基因概述30-31
• 1.4.2 內(nèi)參基因篩選研究動(dòng)態(tài)31-32
• 1.5 研究思路與技術(shù)路線32-34
• 1.5.1 研究思路32-33
• 1.5.2 技術(shù)路線33-34
• 2 百合鱗莖總RNA高效提取體系的建立34-45
• 2.1 材料與方法34-37
• 2.1.1 植物材料34
• 2.1.2 主要試劑34-35
• 2.1.3 外源RNase的去除35
• 2.1.4 試驗(yàn)方法35-37
• 2.2 結(jié)果與分析37-42
• 2.2.1 改良SDS法提取RNA的凝膠電泳分析37-41
• 2.2.2 TRIzol法提取RNA效果41
• 2.2.3 RT-PCR擴(kuò)增效果41-42
• 2.2.4 CTAB法提取百合鱗莖不同部位RNA效果42
• 2.3 討論42-45
• 2.3.1 防止RNase污染、RNA降解的措施42-43
• 2.3.2 提取方法的選擇43-45
• 3 基于Illumina平臺(tái)的百合小鱗莖形成與發(fā)育轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究45-55
• 3.1 材料與方法45-46
• 3.1.1 材料45
• 3.1.2 試劑45
• 3.1.3 RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建、測(cè)序及組裝45-46
• 3.1.4 基因功能注釋46
• 3.1.5 SSR分析46
• 3.1.6 unigene預(yù)測(cè)編碼蛋白區(qū)CDS46
• 3.2 結(jié)果與分析46-53
• 3.2.1 小鱗莖形成與發(fā)育過程分析46-47
• 3.2.2 測(cè)序和組裝結(jié)果47
• 3.2.3 基因注釋和功能分類47-52
• 3.2.4 SSR分析結(jié)果52
• 3.2.5 編碼區(qū)預(yù)測(cè)和蛋白序列翻譯52-53
• 3.3 討論53-55
• 4 百合qRT-PCR內(nèi)參基因的篩選55-67
• 4.1 材料與方法55-57
• 4.1.1 材料55
• 4.1.2 試劑55-56
• 4.1.3 RNA提取及cDNA合成56
• 4.1.4 候選內(nèi)參基因引物設(shè)計(jì)56
• 4.1.5 內(nèi)參基因的qRT-PCR分析56-57
• 4.1.6 表達(dá)穩(wěn)定性分析57
• 4.2 結(jié)果與分析57-65
• 4.2.1 引物特異性分析57-58
• 4.2.2 引物的擴(kuò)增效率分析58-59
• 4.2.3 內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析59-65
• 4.3 討論65-67
• 5 百合小鱗莖發(fā)育不同階段表達(dá)譜構(gòu)建及特征分析67-81
• 5.1 材料與方法67-69
• 5.1.1 材料67
• 5.1.2 試劑67
• 5.1.3 RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建、測(cè)序及組裝67-68
• 5.1.4 基因差異表達(dá)分析68
• 5.1.5 差異表達(dá)基因功能分析68
• 5.1.6 淀粉和蔗糖含量測(cè)定68
• 5.1.7 淀粉-蔗糖代謝關(guān)鍵酶基因的qRT-PCR分析68-69
• 5.2 結(jié)果與分析69-78
• 5.2.1 差異表達(dá)基因的分布69-70
• 5.2.2 不同樣品間的差異表達(dá)基因比較70
• 5.2.3 差異表達(dá)基因的GO分析70-72
• 5.2.4 差異表達(dá)基因的通路分析72-73
• 5.2.5 淀粉-蔗糖代謝相關(guān)基因功能富集分析73-75
• 5.2.6 淀粉和蔗糖含量測(cè)定結(jié)果75
• 5.2.7 淀粉-蔗糖代謝相關(guān)酶的qRT-PCR檢測(cè)75-78
• 5.3 討論78-81
• 5.3.1 百合小鱗莖發(fā)育不同階段表達(dá)譜78-79
• 5.3.2 淀粉-蔗糖代謝作用79
• 5.3.3 小鱗莖形成與發(fā)育過程中的基因表達(dá)79-81
• 6 SuSy與INV基因的載體構(gòu)建81-98
• 6.1 材料與方法81-92
• 6.1.1 主要試劑81
• 6.1.2 試驗(yàn)所用的菌株與載體81-82
• 6.1.3 SuSy3過表達(dá)載體的構(gòu)建82-84
• 6.1.4 SuSy3 RNAi載體的構(gòu)建84-86
• 6.1.5 S1、S2和SAI過表達(dá)載體的構(gòu)建86-88
• 6.1.6 S1、S2及SAIRNAi載體的構(gòu)建88-92
• 6.2 結(jié)果與分析92-97
• 6.2.1 SuSy3過表達(dá)載體的構(gòu)建92-93
• 6.2.2 SuSy3 RNAi載體的構(gòu)建93-94
• 6.2.3 S1、S2、SAI過表達(dá)載體的構(gòu)建94-96
• 6.2.4 S1、S2及SAIRNAi載體的構(gòu)建96-97
• 6.3 討論97-98
• 全文總結(jié)98-101
• 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)101-102
• 參考文獻(xiàn)102-128
• 附錄128-129
• 致謝129-130
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文130-131
• 附件131

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：基于RNA-Seq的蘭州百合鱗莖淀粉-蔗糖代謝關(guān)鍵酶SuSy和INV基因的挖掘，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：403742