藏羊是我國典型的粗毛羊品種,其羊毛以初級毛囊形成的髓狀毛為主,是優(yōu)質(zhì)的地毯毛來源,目前關(guān)于地毯毛性狀的遺傳機(jī)制報(bào)道較少。胚胎發(fā)育過程中,表皮細(xì)胞與真皮細(xì)胞的信號分子之間相互作用,誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞增殖分化形成初級毛囊。分析藏羊初級毛囊誘導(dǎo)形成過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),篩選參與調(diào)控初級毛囊誘導(dǎo)形成的關(guān)鍵基因,挖掘地毯毛性狀相關(guān)的種質(zhì)資源,對提高羊毛品質(zhì)具有重要意義。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序分析藏羊初級毛囊發(fā)育誘導(dǎo)期的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和信使RNA（messenger RNA,mRNA）的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),解析初級毛囊早期發(fā)育過程中相互作用的關(guān)鍵激活因子EDAR和抑制因子BMP4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,闡明其誘導(dǎo)藏羊初級毛囊形成的潛在分子機(jī)制。具體結(jié)果如下:1.藏羊初級毛囊發(fā)育誘導(dǎo)期關(guān)鍵lncRNAs和mRNAs的篩選和鑒定通過組織形態(tài)學(xué)分析藏羊胚胎的皮膚結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)初級毛囊誘導(dǎo)形成時(shí)期（stage 1）相比于誘導(dǎo)形成前時(shí)期（stage 0）,皮膚的表皮和真皮明顯增厚,并形成毛囊基板和真皮凝集體。通過分析藏羊初級毛囊誘導(dǎo)形成前后皮膚轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)鑒定到36個(gè)顯著上調(diào)的...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 綜述
    1 前言
    2 毛囊的發(fā)育及其分期
    3 調(diào)控毛囊發(fā)育的關(guān)鍵信號通路
        3.1 WNT信號通路在毛囊發(fā)育中的研究進(jìn)展
        3.2 EDAR信號通路在毛囊發(fā)育中的研究進(jìn)展
        3.3 BMP信號通路在毛囊發(fā)育中的研究進(jìn)展
        3.4 FGF信號通路在毛囊發(fā)育中的研究進(jìn)展
        3.5 初級毛囊發(fā)育誘導(dǎo)期EDAR和 BMPs的互作
    4 非編碼RNA在毛囊發(fā)育中的研究進(jìn)展
        4.1 miRNA在毛囊發(fā)育中的研究進(jìn)展
        4.2 LncRNA在毛囊發(fā)育中的研究進(jìn)展
    5 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制
        5.1 啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        5.2 miRNA對基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用
    6 研究目的和意義
第二章 材料與方法
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 試驗(yàn)樣品
        1.2 主要儀器與設(shè)備
        1.3 主要試劑和試劑盒
        1.4 主要試劑配制
        1.5 細(xì)胞系和載體
        1.6 主要的生物信息學(xué)網(wǎng)站和分析軟件
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 皮膚形態(tài)學(xué)分析
            2.1.1 石蠟切片
            2.1.2 蘇木精&伊紅(Hematoxylin and eosin,H&E)染色
        2.2 總RNA提取和c DNA合成
            2.2.1 總RNA提取
            2.2.2 cDNA反轉(zhuǎn)錄
        2.3 基因組DNA的提取
        2.4 轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析
            2.4.1 RNA質(zhì)量檢測、cDNA文庫構(gòu)建和測序
            2.4.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測和序列比對組裝
            2.4.3 LncRNA的篩選和鑒定
            2.4.4 LncRNA與mRNA的結(jié)構(gòu)比較
            2.4.5 LncRNA和mRNA的表達(dá)水平分析
            2.4.6 LncRNA靶基因預(yù)測
            2.4.7 LncRNA和 mRNA的功能富集分析
            2.4.8 互作網(wǎng)絡(luò)分析
        2.5 qRT-PCR
        2.6 切片原位雜交
            2.6.1 候選lncRNA的克隆
            2.6.2 原位雜交探針制備
            2.6.3 切片原位雜交
        2.7 候選基因啟動(dòng)子缺失載體的構(gòu)建
        2.8 候選基因啟動(dòng)子活性分析
            2.8.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、凍存和轉(zhuǎn)染
            2.8.2 雙熒光素酶活性的檢測
        2.9 候選基因核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測
        2.10 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變載體的構(gòu)建
        2.11 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變載體的雙熒光素酶活性檢測
        2.12 轉(zhuǎn)錄因子超表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.13 核心啟動(dòng)子區(qū)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子超表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞
        2.14 轉(zhuǎn)錄因子的超表達(dá)
        2.15 與候選基因3’UTR結(jié)合的miRNA預(yù)測
        2.16 候選基因3’UTR雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建
        2.17 候選基因3’UTR突變型雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建
        2.18 miRNA與候選基因結(jié)合位點(diǎn)的驗(yàn)證
        2.19 miRNA對候選基因表達(dá)水平的影響
第三章 結(jié)果與分析
    1 藏羊初級毛囊發(fā)育誘導(dǎo)期關(guān)鍵lncRNAs、mRNAs的篩選和鑒定
        1.1 藏羊初級毛囊發(fā)育誘導(dǎo)期皮膚形態(tài)學(xué)分析
        1.2 藏羊初級毛囊發(fā)育誘導(dǎo)期皮膚轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析
            1.2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量
            1.2.2 參考序列比對
            1.2.3 樣品間相關(guān)性分析
            1.2.4 候選lncRNAs和mRNAs的篩選
            1.2.5 LncRNAs與mRNAs的結(jié)構(gòu)比較
            1.2.6 差異表達(dá)lncRNAs與mRNAs的鑒定
            1.2.7 差異表達(dá)lncRNAs靶基因與差異表達(dá)mRNAs GO分析
            1.2.8 差異表達(dá)lncRNAs靶基因與差異表達(dá)mRNAs KEGG分析
            1.2.9 差異表達(dá)mRNA-mRNA、lncRNA-mRNA的互作網(wǎng)絡(luò)分析
        1.3 qRT-PCR檢測藏羊初級毛囊發(fā)育誘導(dǎo)期關(guān)鍵lncRNAs的表達(dá)水平
        1.4 切片原位雜交檢測藏羊XLOC₂97809和XLOC₇64219的表達(dá)
        1.5 qRT-PCR檢測藏羊初級毛囊發(fā)育誘導(dǎo)期關(guān)鍵基因的表達(dá)水平
            1.5.1 qRT-PCR檢測WNT信號通路中差異基因的表達(dá)水平
            1.5.2 qRT-PCR檢測EDAR信號通路中差異基因的表達(dá)水平
            1.5.3 qRT-PCR檢測BMP信號通路中差異基因的表達(dá)水平
            1.5.4 qRT-PCR檢測其它關(guān)鍵差異基因的表達(dá)水平
    2 藏羊EDAR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究
        2.1 藏羊EDAR啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制
            2.1.1 EDAR啟動(dòng)子缺失載體構(gòu)建
            2.1.2 EDAR啟動(dòng)子活性分析
            2.1.3 EDAR啟動(dòng)子進(jìn)一步缺失載體構(gòu)建
            2.1.4 EDAR啟動(dòng)子活性進(jìn)一步分析
            2.1.5 EDAR核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測
            2.1.6 EDAR核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變
            2.1.7 超表達(dá)ETS1對EDAR啟動(dòng)子活性的影響
            2.1.8 超表達(dá)ETS1對EDAR基因表達(dá)水平的影響
        2.2 miRNA對藏羊EDAR基因表達(dá)的調(diào)控
            2.2.1 與EDAR基因3’UTR結(jié)合的miRNA預(yù)測
            2.2.2 miR-125a-5p和 miR-24-3p的成熟序列保守性分析
            2.2.3 EDAR基因3’UTR與miRNA的結(jié)合位點(diǎn)分析
            2.2.4 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證
            2.2.5 miR-125a-5p對 EDAR基因表達(dá)水平的影響
    3 藏羊BMP4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究
        3.1 藏羊BMP4啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制
            3.1.1 BMP4啟動(dòng)子缺失載體構(gòu)建
            3.1.2 BMP4啟動(dòng)子活性分析
            3.1.3 BMP4核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測
            3.1.4 BMP4核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變
            3.1.5 超表達(dá)MYC和SP1對BMP4啟動(dòng)子活性的影響
            3.1.6 超表達(dá)MYC和SP1對BMP4基因表達(dá)水平的影響
        3.2 miRNA對藏羊BMP4基因表達(dá)的調(diào)控
            3.2.1 與BMP4基因3’UTR結(jié)合的miRNA預(yù)測
            3.2.2 miR-340-5p的成熟序列保守性分析
            3.2.3 BMP4 基因3’UTR與miRNA的結(jié)合位點(diǎn)分析
            3.2.4 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證
            3.2.5 miR-340-5p對BMP4基因表達(dá)水平的影響
第四章 討論
    1 藏羊初級毛囊發(fā)育誘導(dǎo)期形態(tài)學(xué)分析
    2 調(diào)控藏羊初級毛囊誘導(dǎo)形成的關(guān)鍵mRNAs
    3 調(diào)控藏羊初級毛囊誘導(dǎo)形成的關(guān)鍵lncRNAs
    4 調(diào)控藏羊初級毛囊誘導(dǎo)形成的候選基因的選擇
    5 候選基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究
    6 調(diào)控藏羊初級毛囊誘導(dǎo)形成的候選lncRNAs、基因、轉(zhuǎn)錄因子和miRNAs
第五章 結(jié)論
    1 主要結(jié)論
    2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文
致謝



本文編號：4025155