本文關(guān)鍵詞：博卡病毒感染的檢測和原始抗原效應的相關(guān)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：博卡病毒是近幾年被發(fā)現(xiàn)的一種人、豬、牛、犬、猩猩等多種哺乳動物共患的新型DNA病毒。人類博卡病毒(human bocavirus,HBoV)是2005年最早發(fā)現(xiàn)的新型博卡病毒。有相關(guān)研究指出HBo V存在于黑猩猩、大猩猩等靈長類動物,與大猩猩博卡病毒有著極其高的同源性;此外,研究HBo V的免疫學特性有利于更好的理解和研究其他新興的動物博卡病毒。人類博卡病毒1型(HBoV1)普遍存在幼兒體內(nèi),有可能會引起急性呼吸系統(tǒng)疾病。另外三種人類博卡病毒(HBoV2-4)的感染常發(fā)生于胃腸道,可能與嬰幼兒腹瀉或胃腸炎相關(guān)。世界各地均有在血清、呼吸道等樣本中檢測到博卡病毒的報道;但博卡病毒的致病機理還不清楚。當一些個體先后感染兩種相似的毒株后,機體產(chǎn)生的是針對初始感染毒株的抗體,而不是目前感染毒株的抗體。這種具有抗原相似性的病毒在免疫應答上相互影響的現(xiàn)象,自1950年以來一直被稱為“原始抗原效應”(original antigenic sin,OAS)。本研究采用3種不同的檢測方法-熒光定量PCR(q PCR)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)及MariPOC抗原檢測系統(tǒng)-檢測鼻咽腔分泌物樣本中HBoV1的存在。在269份樣本中,HBoV1 DNA在qPCR中的陽性率為8.1%(22/269),樣品中的拷貝數(shù)在5.13E+01到7.23E+09copies/mL之間。RT-PCR陽性率為3.35%(9/269),MariPOC抗原檢測系統(tǒng)陽性率為3.71%(10/269),兩者檢測到病毒對應的DNA的最小拷貝數(shù)約為107copies/mL。初步判定在呼吸道樣本中HBoV1 DNA拷貝數(shù)大于107copies/mL時,病毒處于急性感染期。為了研究HBoV感染在人體內(nèi)的相互作用,本研究針對從過百名兒童從出生起按照每3-6個月的間隔收集的近兩千份血清進行了研究。在該人群中,HBoV1 DNA的檢出率最高為24%;HBoV2-4DNA的檢出率分別為6%、1%和1%�？笻Bo V1 IgM的陽性率為32%,HBoV2 IgM的陽性率為10%,并未發(fā)現(xiàn)HBoV3 IgM的陽性樣本�？笻BoV1-3 IgG中陽性率最高的為抗HBoV1 IgG(86.2%);抗HBoV2 IgG的陽性率為53.2%,抗HBoV3 IgG的陽性率為10.1%。上述結(jié)果均表明HBoV1的感染率最高,其次為HBoV2,HBoV3最差。上述血清樣本中,發(fā)現(xiàn)在有一種以上HBoV的感染的兒童中,一些個體在感染第二種HBoV后,繼發(fā)性的感染并不能導致特異性的抗體響應。因此認為HBoV1-4的感染存在原始抗原效應,本文對其進行后續(xù)研究。為了能夠在可控條件下研究在人類血清中觀測到的原始抗原效應,本研究利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng),構(gòu)建了HBoV4 VP2蛋白的病毒樣粒子并大規(guī)模表達了HBoV1-4 VP2蛋白的病毒樣粒子,同時優(yōu)化了將用于測試原始抗原效應的檢測方法。首先,成功構(gòu)建了pAcUW51-HBoV4-VP2桿狀病毒載體,進行體外鑒定無誤后,提取重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞,收獲重組病毒并表達了目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE鑒定,重組蛋白在High5昆蟲細胞中獲得表達,蛋白大小為62kDa。Western blot檢測結(jié)果表明表達的蛋白可與HBoV4陽性血清發(fā)生特異性反應,證實所表達的蛋白具有良好的抗原性。對裂解后的細胞上清進行了氯化銫密度梯度離心,PBS重懸后負染電鏡觀察,電鏡下觀察到22nm左右的類似HBoV4的球形粒子,進一步證實病毒樣粒子構(gòu)建成功。然后,利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)大規(guī)模表達了HBoV1-4 VP2蛋白的病毒樣粒子,并利用氯化銫超速離心純化蛋白,SDS-PAGE顯示其大小與預測一致,純度良好。使用非阻斷和阻斷IgG ELISA,證明其抗原性良好。然后使用純化后的HBoV4重組蛋白初步建立了HBoV4間接IgG ELISA方法。初步確定了臨界值,當血清樣品OD492nm≥0.243時,檢測結(jié)果可判定為陽性,OD492nm0.243時為陰性。對已有的10個HBoV4陽性樣本進行檢測,符合率為100%。在使用HBoV1-3抗原阻斷交叉抗體后,使用HBoV4間接ELISA檢測192份兒童血清樣品,其陽性率為3.6%(7/192)。并針對兔源血清,對已有的HBoV1-4間接IgG ELISA方法進行了改良。改良后,兔源血清最佳稀釋度為1:1000,阻斷抗原最佳濃度為30mg/mL;豬抗兔IgG/HRP的最佳使用濃度為1:2000。隨后,利用人類細小病毒B19(B19V)及上述HBoV1-4病毒樣粒子,采用10組不同的組合方式免疫家兔。第一種HBoV或B19V抗原接種60天后,接種第二種HBoV或B19V抗原,并從接種前直到接種后120天期間定期收集血清。通過非阻斷和異源阻斷HBoV IgG ELISA對HBoV1-4 IgG抗體進行血清學分析,結(jié)果表明所有的兔子均表現(xiàn)出明顯的抗體反應。B19V并不會與HBo V1產(chǎn)生原始抗原效應,同源抗原HBoV1和HBoV2加強免疫后,抗該抗原的IgG抗體水平并未明顯增加。在異源HBoV的組合內(nèi)有一半的兔子顯示出了不同程度的原始抗原效應,這與本研究在人類血清學研究中的得到的結(jié)果一致。對上述表現(xiàn)為不同程度原始抗原效應實驗動物進行了抗體動力學分析,并通過第三方HBoV IgG ELISA檢測交叉反應抗體的變化水平。對于再次免疫抗原為HBo V1的實驗動物,發(fā)生原始抗原效應幾率較大(66%)。而對于再次免疫抗原為HBoV2的實驗動物,發(fā)生原始抗原效應幾率較小(25%)。博卡病毒是第一個展現(xiàn)出原始抗原效應現(xiàn)象的細小病毒。本研究結(jié)果為HBoV1-4免疫研究提供了新的方向,并證實了人類博卡病毒診斷學的復雜性。為未來HBoV血清學診斷和疫苗的研制提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：博卡病毒 感染檢測 原始抗原效應
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要10-12
• 英文摘要12-15
• 1 前言15-41
• 1.1 細小病毒概述15-20
• 1.1.1 細小病毒科15-16
• 1.1.2 博卡病毒屬16-18
• 1.1.3 常見的動物博卡病毒18-20
• 1.2 人類博卡病毒20-29
• 1.2.1 研究歷史20
• 1.2.2 結(jié)構(gòu)及基因組20-22
• 1.2.3 HBoV1-4 的進化關(guān)系22-23
• 1.2.4 HBoV1-4 流行與分布23-29
• 1.3 病毒樣粒子29-33
• 1.3.1 VLPs表達系統(tǒng)的選擇29-31
• 1.3.2 VLPs在免疫學檢測中的應用31
• 1.3.3 VLPs在疫苗中的應用31-33
• 1.4 原始抗原效應33-40
• 1.4.1 研究歷史33-34
• 1.4.2 特征34-35
• 1.4.3 原始抗原效應與病原體35-37
• 1.4.4 潛在機理37-38
• 1.4.5 臨床重要性38-40
• 1.5 本研究的目的與意義40-41
• 2 材料與方法41-62
• 2.1 試驗材料41-45
• 2.1.1 樣本的采集41
• 2.1.2 質(zhì)粒、細胞及動物41
• 2.1.3 試劑41-42
• 2.1.4 抗體和耗材42
• 2.1.5 主要溶液配制42-43
• 2.1.6 主要儀器43-44
• 2.1.7 引物設計44-45
• 2.2 HBoV1-4 的檢測方法45-49
• 2.2.1 HBoV1的MariPOC抗原檢測系統(tǒng)45-46
• 2.2.2 HBoV1-4 多重熒光定量PCR46-48
• 2.2.3 HBoV1-4 單重熒光定量PCR48
• 2.2.4 HBoV1-3 IgM ELISA48-49
• 2.2.5 HBoV1-3 IgG ELISA49
• 2.3 免疫原的制備及檢測方法優(yōu)化49-58
• 2.3.1 HBoV4病毒樣粒子構(gòu)建、表達及鑒定49-55
• 2.3.2 HBoV1-4 免疫原的制備55-56
• 2.3.3 HBoV4間接IgG ELISA方法的初步建立56-58
• 2.3.4 HBoV1-4 IgG間接ELISA在兔血清的改良58
• 2.4 原始抗原效應的驗證58-62
• 2.4.1 動物免疫58-60
• 2.4.2 非阻斷ELISA60-61
• 2.4.3 阻斷ELISA61-62
• 3 結(jié)果與分析62-98
• 3.1 HBoV1-4 感染的檢測62-67
• 3.1.1 呼吸道樣本62-64
• 3.1.2 血清樣本64-67
• 3.2 免疫原的制備及檢測方法優(yōu)化67-78
• 3.2.1 HBoV4病毒樣粒子的構(gòu)建67-70
• 3.2.2 HBoV1-4 免疫原的制備70-73
• 3.2.3 HBoV4間接ELISA的初步建立73-76
• 3.2.4 HBoV1-4 IgG ELISA在兔血清的改良76-78
• 3.3 原始抗原效應相關(guān)分析78-98
• 3.3.1 同源HBoV組合78-81
• 3.3.2 B19V對照組81-85
• 3.3.3 異源HBoV組合85-89
• 3.3.4 疑似原始抗原效應存在個體的抗體動力學曲線89-95
• 3.3.5 特殊個體的交叉反應抗體動力學曲線95-98
• 4 討論98-105
• 4.1 HBoV與動物感染98-99
• 4.2 HBoV新型檢測方法99-101
• 4.3 HBoV感染的檢測與分析101-102
• 4.4 原始抗原效應102-105
• 4.4.1 HBoV組合的選擇102-103
• 4.4.2 免疫動物的選擇103
• 4.4.3 免疫劑量及時間間隔的影響103-104
• 4.4.4 不同HBoV組合的免疫效果及原始抗原效應104-105
• 5 結(jié)論105-106
• 致謝106-107
• 參考文獻107-118
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文118

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 宋麗麗;畢玉_g;甘書鉆;孫新寬;磨美蘭;;冠狀病毒顆粒樣疫苗研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2014年04期

2 竇小龍;任曉冰;魏婕;苗書魁;冉多良;馬文戈;;口蹄疫病毒VP1蛋白病毒樣顆粒表達系統(tǒng)的構(gòu)建[J];動物醫(yī)學進展;2014年03期

3 孫利紅;黃象安;楊軍勇;楊蕭星;王建芳;陳燕力;李安德;王曉才;;人類博卡病毒致成人急性呼吸道感染的臨床研究[J];北京醫(yī)學;2014年06期

4 鄧中華;曹友德;;人博卡病毒病毒樣顆粒研究進展[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2014年14期

5 張慶勛;劉新生;周鵬;方玉珍;王永錄;張永光;;口蹄疫病毒病毒樣顆粒研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年11期

6 魏婕;魏玉榮;易忠;;口蹄疫病毒樣顆粒研究進展[J];草食家畜;2015年04期

7 袁媛;劉鑫;周婭;段躍強;楊曉嵐;張立;趙忠鵬;王希良;;重組EV71和CVA16型手足口病雙價VLP疫苗構(gòu)建及免疫保護效果評價[J];免疫學雜志;2014年06期

8 李少偉;夏寧邵;;大腸桿菌表達的病毒樣顆粒疫苗[J];生命的化學;2014年01期

9 WU Jian Jun;JIN Yu;LIN Na;XIE Zhi Ping;YU Jie Mei;LI Jin Song;CAO Chang Qing;YUAN Xin Hui;SONG Jin Rong;ZHANG Jing;ZHAO Yang;GAO Xiao Qian;DUAN Zhao Jun;;Detection of Human Bocavirus in Children with Acute Respiratory Tract Infections in Lanzhou and Nanjing,China[J];Biomedical and Environmental Sciences;2014年11期

10 楊美慶;劉文權(quán);梁韶暉;;病毒樣顆粒疫苗的研究進展[J];溫州醫(yī)學院學報;2013年08期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 趙慧;兒童腹瀉相關(guān)的人博卡病毒2型的初步研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2013年

2 唐帥;Eppin優(yōu)勢表位自組裝納米避孕疫苗的構(gòu)建及實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2013年

3 王秋霞;小反芻獸疫病毒樣顆粒的裝配與釋放研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2013年

4 王曉雯;高致病小RNA病毒病毒樣顆粒的制備及部分顆粒的免疫研究[D];北京工業(yè)大學;2013年

5 劉拂曉;小反芻獸疫病毒樣顆粒的構(gòu)建及對小鼠免疫效力的評價[D];吉林大學;2013年

6 李京京;人類博卡病毒HBoV1基因組克隆及轉(zhuǎn)錄、翻譯分子機制研究[D];華中師范大學;2012年

7 常海艷;既往季節(jié)性流感病毒感染對流感疫苗接種效果影響的研究[D];湖南師范大學;2011年

8 齊瑛琳;狂犬病病毒樣顆粒的構(gòu)建、制備及免疫效果評價[D];吉林大學;2015年

9 陳爭光;金欣口服液對RSV誘導的TLR3/RIG-I信號通路的調(diào)控作用的研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2015年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 胡桂秋;犬細小病毒樣粒子制備及其實驗免疫研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2013年

2 張浩;草兔卵透明帶3（ZP3）基因的克隆分析及原核表達初探[D];西北農(nóng)林科技大學;2013年

3 喬緒穩(wěn);豬圓環(huán)病毒2型GEM顆粒疫苗的初步研究[D];揚州大學;2013年

4 黃戀;禽流感H9N2型病毒基質(zhì)蛋白2（M2）的免疫效果研究[D];湖南師范大學;2011年

5 刁文真;PCV2b病毒樣顆粒疫苗的制備及檢測[D];吉林大學;2014年

6 陳歡;穩(wěn)定表達雞ST3GAL Ⅰ的BHK-21細胞株的構(gòu)建及禽流感病毒的增殖[D];河北農(nóng)業(yè)大學;2013年

7 董虎;南非2型口蹄疫病毒樣顆粒體外組裝及嵌合病毒樣顆粒的初步研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2014年

8 藍丹丹;桿狀病毒AcMNPV ac124基因功能的研究[D];揚州大學;2014年

9 趙曉云;PCV2病毒樣顆粒疫苗的制備及免疫原性研究[D];揚州大學;2014年

10 趙冀楠;我國雞群禽戊型肝炎病毒感染的血清學和分子流行病學調(diào)查[D];西北農(nóng)林科技大學;2014年

  本文關(guān)鍵詞：博卡病毒感染的檢測和原始抗原效應的相關(guān)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：397461