本文關(guān)鍵詞：蘋果內(nèi)參基因的篩選及三種潛隱性病毒TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：病毒病嚴重影響蘋果的生長、產(chǎn)量以及果品質(zhì)量,尚無有效防治藥劑,樹體一旦侵染很難根除,繁育無病毒苗木實行無毒化栽培是其防治的最有效途徑。高效、靈敏、穩(wěn)定的病毒檢測技術(shù)是實現(xiàn)蘋果無毒化栽培的重要技術(shù)保障之一。本研究在篩選出適用于蘋果的內(nèi)參基因的基礎(chǔ)上,分別建立了蘋果Actin基因及蘋果莖溝病毒、莖痘病毒、褪綠葉斑病毒三種蘋果潛隱性病毒的TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR檢測方法,旨在為進一步研究三種潛隱性病毒的侵染、增殖、分布以及時序變化等規(guī)律提供有效的技術(shù)手段,并為蘋果病毒的多重實時熒光定量RT-PCR檢測體系的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1、本研究采用SYB GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR技術(shù),對Actin、TUB、GAPDH、18SrRNA、UBQ、nad5六個持家基因在蘋果幼葉、成齡葉、枝皮、根皮和種子中的表達量進行了檢測。經(jīng)GeNorm軟件分析發(fā)現(xiàn),6個內(nèi)參基因在五種不同組織器官中的表達穩(wěn)定性由高到低排列順序為:Actin=UBQ㧐GAPDH㧐nad5㧐TUB㧐18SrRNA,Actin和UBQ為優(yōu)選內(nèi)參基因。2、首次建立了蘋果Actin基因的TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR檢測方法。本研究根據(jù)已公布的Actin基因序列設(shè)計了特異性引物和TaqMan探針,以體外轉(zhuǎn)錄的RNA為標準品繪制標準曲線,并對該方法的特異性、靈敏性和重復性進行檢驗。結(jié)果顯示建立的標準曲線相關(guān)系數(shù)達0.999,擴增效率為106.5%;該方法的引物和探針特異性強;檢測靈敏度為1.48×10 copies·μL-1的cRNA,比常規(guī)RT-PCR高1000倍;重復性好,組內(nèi)和組間重復變異系數(shù)均小于2.65%。3、建立了蘋果莖溝病毒TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR檢測方法。本研究根據(jù)蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)外殼蛋白基因(coat protein,cp)保守序列設(shè)計了特異性引物和TaqMan探針,以構(gòu)建的ASGV-cp重組質(zhì)粒為標準品繪制標準曲線,并對該方法的特異性、靈敏性和重復性進行檢驗。建立的標準曲線相關(guān)系數(shù)達0.999,擴增效率為96.8%;該方法特異性好,與蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)均無交叉反應(yīng);靈敏度為10copies·μL-1,比常規(guī)RT-PCR高1000倍;組內(nèi)和組間重復變異系數(shù)均小于1%。表明該方法具有特異性強、靈敏高、重復性好的優(yōu)點,適用于實際樣品中ASGV的快速準確檢測。4、建立了蘋果褪綠葉斑病毒TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR檢測方法。根據(jù)ACLSV cp基因的保守序列設(shè)計了特異性引物和TaqMan探針,以構(gòu)建的ACLSV-cp重組質(zhì)粒為標準品繪制標準曲線,并對該方法的特異性、靈敏性、重復性進行檢驗。結(jié)果顯示,以ACLSV-cp重組質(zhì)粒為標準品建立的標準曲線相關(guān)系數(shù)達0.999,擴增效率為103.7%;建立的TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR方法特異性好,與ASGV、ASPV和ASSVd均無交叉反應(yīng);靈敏度為100 copies·μL-1,比常規(guī)RT-PCR高100倍;組內(nèi)和組間重復變異系數(shù)均小于0.84%。表明TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR方法具有特異性強、靈敏高、重復性好的優(yōu)點,適用于實際樣品中ACLSV的快速準確檢測。5、建立了蘋果莖痘病毒TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR檢測方法。根據(jù)ASPV cp基因的保守序列設(shè)計了特異性引物和TaqMan探針,以體外轉(zhuǎn)錄的RNA為標準品繪制標準曲線,并對該方法的特異性、靈敏性、重復性進行檢驗。建立的標準曲線相關(guān)系數(shù)達0.996,擴增效率為99%;該方法特異性好,與ASGV、ACLSV及ASSVd均無交叉反應(yīng);其最低檢測限為1.31×102 copies·μL-1,靈敏度比常規(guī)RT-PCR高100倍;組內(nèi)和組間重復變異系數(shù)均小于1.85%。該方法具有特異性強、靈敏高、重復性好的優(yōu)點,適用于實際樣品中ASPV的快速定量檢測。
【關(guān)鍵詞】：蘋果 內(nèi)參基因 蘋果莖溝病毒 蘋果褪綠葉斑病毒 蘋果莖痘病毒 TaqMan探針 實時熒光定量RT-PCR
【學位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S661.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-14
• 第一章 引言14-26
• 1 實時熒光定量PCR技術(shù)概述14-18
• 1.1 實時熒光定量PCR基本原理14-15
• 1.2 實時熒光定量PCR檢測方法15-16
• 1.2.1 熒光嵌合法（SYBR GreenⅠ）15
• 1.2.2 TaqMan探針法15-16
• 1.2.3 分子信標法（Molecular beacons）16
• 1.3 實時熒光定量PCR技術(shù)的定量方法16-17
• 1.3.1 絕對定量法16-17
• 1.3.2 相對定量法17
• 1.4 實時熒光定量PCR在植物植物病理學研究中的應(yīng)用17-18
• 2 內(nèi)參基因概述18-19
• 2.1 常用的內(nèi)參基因18
• 2.2 內(nèi)參基因的選擇18-19
• 3 蘋果病毒病概述19-24
• 3.1 蘋果病毒病概況19-20
• 3.2 蘋果病毒的傳播途徑20
• 3.3 蘋果病毒病的防控措施20-21
• 3.4 蘋果潛隱性病毒的檢測方法21-23
• 3.4.1 指示植物法21
• 3.4.2 電子顯微鏡技術(shù)21-22
• 3.4.3 血清學方法22
• 3.4.3 分子生物學技術(shù)22-23
• 3.5 三種蘋果潛隱性病毒23-24
• 3.5.1 蘋果莖溝病毒23-24
• 3.5.2 蘋果莖痘病毒24
• 3.5.3 蘋果褪綠葉斑病毒24
• 4 本研究的目的意義24-26
• 第二章 蘋果六個內(nèi)參基因的優(yōu)選26-43
• 1 材料與方法26-31
• 1.1 試驗材料26
• 1.2 主要儀器及試劑26
• 1.2.1 主要儀器26
• 1.2.2 主要試劑26
• 1.3 試驗方法26-31
• 1.3.1 總RNA的提取26-27
• 1.3.2 總RNA完整性和純度的檢測27
• 1.3.3 總RNA的純化27-28
• 1.3.4 cDNA的合成28
• 1.3.5 引物的設(shè)計與合成28-29
• 1.3.6 六個內(nèi)參基因的常規(guī)PCR擴增及其引物退火溫度篩選29-30
• 1.3.7 六個內(nèi)參基因的SYBR Green I實時熒光定量PCR反應(yīng)30
• 1.3.8 數(shù)據(jù)分析30-31
• 2 結(jié)果與分析31-41
• 2.1 總RNA的提取31
• 2.2 總RNA的純化及cDNA合成31-32
• 2.3 六個內(nèi)參基因的常規(guī)PCR擴增及其引物退火溫度的篩選32-35
• 2.4 六個內(nèi)參基因的實時熒光定量PCR反應(yīng)35-40
• 2.5 六個內(nèi)參基因的篩選40-41
• 2.5.1 六個內(nèi)參基因的表達水平分析40
• 2.5.2 六個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析40-41
• 3 討論41-43
• 第三章 蘋果Actin基因TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立43-57
• 1 材料與方法43-50
• 1.1 試驗材料43
• 1.2 主要試劑及儀器43
• 1.3 總RNA的提取43
• 1.4 cDNA的合成43
• 1.5 引物與探針的設(shè)計與合成43-44
• 1.6 陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建44-47
• 1.6.1 Actin基因的常規(guī)PCR擴增44
• 1.6.2 目標片段的回收44-45
• 1.6.3 目標片段的克隆45
• 1.6.4 重組質(zhì)粒的提取45-46
• 1.6.5 重組質(zhì)粒的鑒定46-47
• 1.7 cRNA標準品的制備47-48
• 1.7.1 陽性重組質(zhì)粒的線性化處理47
• 1.7.2 cRNA的體外轉(zhuǎn)錄及純化47-48
• 1.8 Actin基因TaqMan探針實時熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立48-50
• 1.8.1 標準曲線的制作48-49
• 1.8.2 反應(yīng)體系與常規(guī)RT-PCR靈敏度的對比49
• 1.8.3 反應(yīng)體系的特異性49
• 1.8.4 反應(yīng)體系的重復性49-50
• 2 結(jié)果與分析50-56
• 2.1 Actin基因的常規(guī)PCR擴增及其產(chǎn)物的回收50-51
• 2.2 陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定51-53
• 2.3 cRNA的體外轉(zhuǎn)錄53
• 2.4 實時熒光定量RT- PCR標準曲線的制作53
• 2.5 實時熒光定量PCR與常規(guī)PCR靈敏度的對比53-55
• 2.6 實時熒光定量PCR的重復性55
• 2.7 實時熒光定量PCR的特異性55-56
• 3 討論56-57
• 第四章 蘋果莖溝病毒TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用57-66
• 1 材料與方法57-59
• 1.1 材料57
• 1.2 主要試劑和儀器：57
• 1.3 引物和探針的設(shè)計合成57-58
• 1.4 總RNA的提取及cDNA的合成58
• 1.5 陽性質(zhì)粒標準品的構(gòu)建58
• 1.6 標準曲線的繪制58-59
• 1.7 實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系的方法學測試59
• 1.7.1 實時熒光定量RT-PCR的特異性試驗59
• 1.7.2 實時熒光定量RT-PCR的靈敏性試驗59
• 1.7.3 實時熒光定量RT-PCR的重復性試驗59
• 1.8 實際樣品的檢測59
• 2 結(jié)果與分析59-65
• 2.1 陽性質(zhì)粒標準品的構(gòu)建59-60
• 2.2 標準曲線的建立60-61
• 2.3 實時熒光定量RT-PCR特異性61
• 2.4 實時熒光定量RT-PCR與常規(guī)RT-PCR靈敏度的比較61-62
• 2.5 實時熒光定量RT-PCR重復性62-63
• 2.6 實際樣品檢測63-65
• 3 討論65-66
• 第五章 蘋果褪綠葉斑病毒TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用66-72
• 1 材料與方法66-68
• 1.1 材料66
• 1.2 方法66-68
• 1.2.1 引物及探針的設(shè)計與合成66-67
• 1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成67
• 1.2.3 重組質(zhì)粒標準品的制備及標準曲線繪制67
• 1.2.4 實時熒光定量RT-PCR特異性、靈敏性、重復性試驗67-68
• 1.2.5 實際樣品檢測68
• 2 結(jié)果與分析68-71
• 2.1 重組質(zhì)粒標準品的鑒定及標準曲線的繪制68
• 2.2 實時熒光定量RT-PCR的特異性68-69
• 2.3 實時熒光定量RT-PCR的靈敏度69-70
• 2.4 實時熒光定量RT- PCR的重復性70
• 2.5 實際樣品檢測結(jié)果70-71
• 3 討論71-72
• 第六章 蘋果莖痘病毒TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用72-80
• 1 材料與方法72-74
• 1.1 材料72
• 1.2 引物及探針的設(shè)計與合成72-73
• 1.3 總RNA的提取及RT-PCR73
• 1.4 陽性質(zhì)粒的構(gòu)建73
• 1.5 標準品cRNA的制備及標準曲線的繪制73-74
• 1.6 實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系的驗證與實際樣品檢測74
• 2 結(jié)果與分析74-79
• 2.1 陽性質(zhì)粒的構(gòu)建74-75
• 2.2 標準曲線的繪制75
• 2.3 實時熒光定量RT-PCR的特異性75-76
• 2.4 實時熒光定量RT-PCR的靈敏度76-77
• 2.5 實時熒光定量RT-PCR的重復性77
• 2.6 實際樣品的檢測結(jié)果77-79
• 3 討論79-80
• 結(jié)論80-81
• 參考文獻81-90
• 在讀期間發(fā)表的論文90-91
• 作者簡歷91-92
• 致謝92-93

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：蘋果內(nèi)參基因的篩選及三種潛隱性病毒TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：392818