發(fā)布時(shí)間：2023-10-08 19:32

　　犬流感病毒(Canine Influenza Virus,CIV)是能夠引起犬只體溫升高、噴嚏、流涕等臨床癥狀的甲型流感病毒,常常繼發(fā)其他病毒性疾病和細(xì)菌性疾病,嚴(yán)重時(shí)可造成呼吸衰竭而死亡。在我國(guó),CIV主要是來源于禽的H3N2亞型流感病毒,經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的適應(yīng)進(jìn)化已經(jīng)能夠在犬群中穩(wěn)定傳播。犬的數(shù)量龐大,在全球至少有七億只,并且大部分是作為人類的寵物伴侶,與人類的關(guān)系非常密切。由于犬的呼吸道具有SAα-2,3和SAα-2,6兩種受體,因此可以同時(shí)感染禽流感病毒和人流感病毒,可能成為導(dǎo)致流感病毒基因重排的潛在的“混合器”。因此,開展犬流感的相關(guān)研究對(duì)公共衛(wèi)生和人類健康的意義重大。天然免疫限制因子Tetherin,又稱為BST-2,CD317或者HM1.24,是Ⅰ型干擾素(Interferon,IFN)誘導(dǎo)產(chǎn)生的跨膜蛋白。Tetherin具有廣譜性的抗病毒活性,利用自身特殊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在病毒出芽過程中將病毒粒子連接在細(xì)胞膜表面,限制病毒的有效釋放。本文首次研究了犬Tetherin限制CIV復(fù)制的能力和作用機(jī)制,結(jié)果如下:1.利用RT-PCR擴(kuò)增比格犬Tetherin基因,將其克隆到p3×FLAG...

【文章頁數(shù)】：114 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 前言
    1.1 研究背景
        1.1.1 流感病毒概述
        1.1.2 犬流感的流行情況
            1.1.2.1 馬源H3N8流感病毒感染犬
            1.1.2.2 禽源H3N2流感病毒感染犬
            1.1.2.3 禽源H5N1流感病毒感染犬
            1.1.2.4 其他亞型流感病毒感染犬
        1.1.3 犬流感病毒粒子的形態(tài)和構(gòu)成
        1.1.4 犬流感病毒編碼的蛋白和功能
        1.1.5 天然免疫限制因子Tetherin研究概述
            1.1.5.1 Tetherin的分子特征和細(xì)胞定位
            1.1.5.2 Tetherin抗病毒機(jī)制
            1.1.5.3 抗Tetherin的病毒拮抗蛋白
        1.1.6 MicroRNA研究概括
            1.1.6.1 MicroRNA的合成途徑及作用機(jī)制
            1.1.6.2 MicroRNA與流感病毒
    1.2 研究目的及意義
    1.3 研究技術(shù)路線
第2章 犬天然免疫因子Tetherin抑制流感病毒機(jī)制的研究
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 毒株、質(zhì)粒和細(xì)胞
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 主要儀器
        2.2.4 相關(guān)試劑配置
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 引物設(shè)計(jì)
        2.3.2 犬外周血淋巴細(xì)胞分離
        2.3.3 細(xì)胞總RNA的提取及其反轉(zhuǎn)錄
        2.3.4 Tetherin基因片段的擴(kuò)增與克隆
        2.3.5 真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達(dá)
        2.3.6 篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系
        2.3.7 病毒空斑純化及病毒滴度測(cè)定
            2.3.7.1 空斑實(shí)驗(yàn)的基本過程
            2.3.7.2 空斑純化
            2.3.7.3 病毒PFU的測(cè)定
        2.3.8 病毒EID50測(cè)定
        2.3.9 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        2.3.10 雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗(yàn)
        2.3.11 免疫共沉淀(Co-IP)
        2.3.12 蛋白免疫印跡(Westernblot)
        2.3.13 生物信息網(wǎng)站及軟件
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 犬Tetherin的生物信息學(xué)分析
            2.4.1.1 犬Tetherin基因的擴(kuò)增
            2.4.1.2 犬Tetherin序列的分析
            2.4.1.3 犬Tetherin蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        2.4.2 犬Tetherin組織表達(dá)譜分析
        2.4.3 犬Tetherin蛋白表達(dá)與定位
        2.4.4 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Tetherin的細(xì)胞系
        2.4.5 犬干擾素和CIV對(duì)犬Tetherin的誘導(dǎo)調(diào)控研究
            2.4.5.1 犬Tetherin啟動(dòng)子序列分析
            2.4.5.2 犬干擾素對(duì)犬Tetherin的誘導(dǎo)表達(dá)
            2.4.5.3 CIV對(duì)犬Tetherin的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.4.6 CCK-8測(cè)定穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系對(duì)CIV的抵抗能力
        2.4.7 Tetherin對(duì)CIV在細(xì)胞增殖能力的影響
        2.4.8 干擾Tetherin基因?qū)IV在細(xì)胞增殖能力的影響
        2.4.9 Tetherin與流感相互作用的蛋白
    2.5 本章小結(jié)
第3章 攻毒犬肺MicroRNA的表達(dá)差異分析
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 毒株、質(zhì)粒、主要試劑和儀器
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 比格犬攻毒實(shí)驗(yàn)
        3.3.2 病毒TCID50測(cè)定
        3.3.3 血凝抑制試驗(yàn)
        3.3.4 犬肺組織HE及IHC
        3.3.5 總RNA提取
        3.3.6 高通量測(cè)序
        3.3.7 熒光定量PCR驗(yàn)證
            3.3.7.1 MicroRNAcDNA第一鏈的合成
            3.3.7.2 MicroRNA引物設(shè)計(jì)
            3.3.7.3 熒光定量PCR反應(yīng)體系配制
        3.3.8 差異表達(dá)MicroRNA目標(biāo)預(yù)測(cè)和功能分析
        3.3.9 雙螢光報(bào)告載體的構(gòu)建
        3.3.10 雙螢光素酶檢測(cè)
        3.3.11 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 CIV對(duì)犬致病性的研究
        3.4.2 MicroRNA分析
            3.4.2.1 測(cè)序結(jié)果的序列長(zhǎng)度分布
            3.4.2.2 犬肺組織MicroRNA表達(dá)譜分析
            3.4.2.3 GO功能顯著性富集分析
            3.4.2.4 KEGG通路富集分析
            3.4.2.5 深度測(cè)序的MicroRNAqRT-PCR驗(yàn)證
        3.4.3 MicroRNA與Tetherin
            3.4.3.1 預(yù)測(cè)靶向Tetherin下游UTR區(qū)域的MicroRNA
            3.4.3.2 qPCR驗(yàn)證預(yù)測(cè)的MicroRNA
            3.4.3.3 雙螢光素酶檢測(cè)
    3.5 本章小結(jié)
全文討論與總結(jié)
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄 研究生期間發(fā)表的文章



本文編號(hào)：3852650