豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)(俗稱藍(lán)耳病)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的豬的一種急性、高度傳染的病毒性傳染病,主要引起以間質(zhì)性肺炎和胸腺萎縮為特征的組織病理學(xué)變化。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)感染豬后引發(fā)的嚴(yán)重免疫抑制,是其造成病理損傷的重要原因。然而,該免疫抑制的發(fā)生機制尚未闡明。據(jù)研究證實,HP-PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1α與NSP4分別與參與抗原遞呈途徑重要的主要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex,MHC)I 類分子的重鏈(SLA-IHC)和輕鏈(β2M)相互作用,引起細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTL)的活化受限,抑制細(xì)...

【文章頁數(shù)】：156 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合征研究進(jìn)展
        1.1.1 病原學(xué)
        1.1.2 PRRSV引起免疫抑制機理
    1.2 免疫蛋白酶體研究進(jìn)展
        1.2.1 免疫蛋白酶體:結(jié)構(gòu)、組裝、調(diào)節(jié)和功能
        1.2.2 免疫蛋白酶體在疾病病理中的作用
        1.2.3 研究免疫蛋白酶體功能的策略
        1.2.4 研究免疫蛋白酶體的意義
    1.3 本研究的目的與意義
第2章 IFN-γ與LPS協(xié)同刺激后PAM細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物與細(xì)胞
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 常用試劑配制
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 主要耗材
        2.1.6 論文中所使用的引物
        2.1.7 統(tǒng)計學(xué)方法
    2.2 實驗方法
        2.2.1 原代豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
        2.2.2 高通量轉(zhuǎn)錄組測序
        2.2.3 細(xì)胞總RNA的提取
        2.2.4 cDNA的合成
        2.2.5 Real-Time PCR (RT-PCR)
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 與MO型PAMs相比,IFN-γ與LPS刺激下PAMs的轉(zhuǎn)錄組分析
        2.3.2 與MO型PAMs相比,M1型PAMs內(nèi)差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)基因的鑒定
        2.3.3 與M0型PAMs相比,M1型PAMs內(nèi)參與限制病毒復(fù)制相關(guān)基因的表達(dá)水平
        2.3.4 與M0型PAMs相比,M1型PAMs內(nèi)參與抗原水解和遞呈相關(guān)基因的表達(dá)水平
    2.4 小結(jié)與討論
第3章 免疫蛋白酶體亞基LMP2,LMP7和MECL-1的克隆及表達(dá)分析
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物、細(xì)胞與病毒
        3.1.2 菌株與質(zhì)粒
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 常用試劑配制
        3.1.5 主要儀器
        3.1.6 主要耗材
        3.1.7 分子生物學(xué)分析軟件
        3.1.8 論文中所使用的引物
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.2 原代豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
        3.2.3 PCR擴增
        3.2.4 膠回收
        3.2.5 TA克隆與細(xì)菌轉(zhuǎn)化試驗
        3.2.6 陽性克隆的鑒定及測序
        3.2.7 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.8 重組質(zhì)粒的提取
        3.2.9 瞬時轉(zhuǎn)染
        3.2.10 BCA法測定蛋白濃度
        3.2.11 Western blotting
        3.2.12 IFA檢測目的蛋白的表達(dá)及細(xì)胞定位
        3.2.13 序列分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 豬LMP2、LMP7和MECL-1的染色體定位和序列分析
        3.3.2 豬LMP2、LMP7和MECL-1的亞細(xì)胞定位
        3.3.3 在豬AMs細(xì)胞系中,PolyI:C誘導(dǎo)免疫蛋白酶體的產(chǎn)生
    3.4 小結(jié)與討論
第4章 免疫蛋白酶體亞基在正常與炎癥條件下豬肺組織的表達(dá)及分布
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗動物、細(xì)胞與病毒
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 常用試劑配制
        4.1.4 主要儀器
        4.1.5 主要耗材
        4.1.6 論文中所使用的引物
    4.2 實驗方法
        4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.2 原代豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
        4.2.3 PRRSV的增殖
        4.2.4 病毒滴度測定
        4.2.5 細(xì)胞總RNA的提取
        4.2.6 cDNA的合成
        4.2.7 Real-Time PCR (RT-PCR)
        4.2.8 BCA法測定蛋白濃度
        4.2.9 Western blotting
        4.2.10 IFA檢測目的蛋白的表達(dá)及細(xì)胞定位
        4.2.11 組織病理切片相關(guān)實驗
        4.2.12 統(tǒng)計學(xué)方法
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 豬肺內(nèi)免疫蛋白酶體的表達(dá)
        4.3.2 在原代AMs中,LMP2表達(dá)的驗證
        4.3.3 在原代AM和傳代AM細(xì)胞系中,IFN-γ誘導(dǎo)免疫蛋白酶體的表達(dá)情況
        4.3.4 PRRSV感染后肺內(nèi)免疫蛋白酶體的表達(dá)情況
        4.3.5 在體外感染PRRSV后,原代AMs中免疫蛋白酶體的表達(dá)情況
    4.4 小結(jié)與討論
第5章 HP-PRRSV抑制IFN-γ介導(dǎo)的免疫蛋白酶體的表達(dá)
    5.1 實驗材料
        5.1.1 實驗動物、細(xì)胞與病毒
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 常用試劑配制
        5.1.4 主要儀器
        5.1.5 主要耗材
        5.1.6 論文中所使用的引物
    5.2 實驗方法
        5.2.1 原代豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
        5.2.2 PRRSV的增殖
        5.2.3 病毒滴度測定
        5.2.4 細(xì)胞總RNA的提取
        5.2.5 cDNA的合成
        5.2.6 Real-Time PCR(RT-PCR)
        5.2.7 BCA法測定蛋白濃度
        5.2.8 Western blotting
        5.2.9 IFA檢測目的蛋白的表達(dá)
        5.2.10 流式細(xì)胞術(shù)
        5.2.11 統(tǒng)計學(xué)方法
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 在PAMs中,HP-PRRSV抑制IFN-γ介導(dǎo)的免疫蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        5.3.2 在PAMs中,HP-PRRSV以劑量依賴的方式抑制IFN-γ介導(dǎo)的免疫蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        5.3.3 在RNA水平上,HP-PRRSV抑制IFN-γ介導(dǎo)的免疫蛋白酶體的誘導(dǎo)表達(dá)
        5.3.4 HP-PRRSV調(diào)控IFN-γ介導(dǎo)免疫蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的分子機制初探
    5.4 小結(jié)與討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡介



本文編號：3844105