精子發(fā)生是一個復(fù)雜的生理過程,對溫度具有高度的敏感性。睪丸是雄性精子發(fā)生的場所,一般情況下處在陰囊內(nèi),懸垂于體外,其溫度比體溫低2～4℃。但近年來由環(huán)境、病理等多種原因誘發(fā)的睪丸熱應(yīng)激成為雄性生殖疾病和不育的一個重要因素。據(jù)統(tǒng)計,睪丸溫度每升高1℃,精子發(fā)生效率降低約14%。熱應(yīng)激的累積,還可導(dǎo)致睪丸萎縮、精子發(fā)生受阻、精子密度下降甚至不育等嚴重后果。睪丸單次熱應(yīng)激或隱睪會引起生精上皮的損傷和生殖細胞的消亡,但其具體的損傷過程及機制尚不完全清楚,不利于生產(chǎn)中應(yīng)對熱應(yīng)激誘發(fā)的雄性生殖細胞損傷的預(yù)防和治療。本研究以小鼠39/42℃水浴20 min睪丸單次熱應(yīng)激為模型,探究熱應(yīng)激引起的生精上皮損傷的病理學(xué)進程,進一步研究熱應(yīng)激后生殖細胞損傷的機制,同時評估褪黑素對熱應(yīng)激誘發(fā)的生殖細胞損傷的預(yù)防和治療效果。并以手術(shù)型隱睪模型為基礎(chǔ),利用組織形態(tài)學(xué)鑒定、免疫組化及單細胞轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析等方法,探究隱睪癥抑制精原細胞分化,導(dǎo)致精子發(fā)生阻滯的分子機制。本研究的主要研究結(jié)果如下:1.單次39℃熱應(yīng)激雖未引起睪丸內(nèi)的明顯損傷,但亞細胞結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)該處理可以誘發(fā)生殖細胞內(nèi)的自噬;而當...

【文章頁數(shù)】：103 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
文獻綜述
    第一章 熱應(yīng)激誘發(fā)睪丸損傷的研究進展
        1.1 精子發(fā)生與睪丸溫度調(diào)控
            1.1.1 精子發(fā)生過程
            1.1.2 精子發(fā)生過程中的自然清除
            1.1.3 睪丸的溫度調(diào)節(jié)
        1.2 熱應(yīng)激對精子發(fā)生的影響
            1.2.1 熱應(yīng)激對睪丸生殖細胞的影響
            1.2.2 熱應(yīng)激對附睪精子的影響
            1.2.3 熱應(yīng)激對睪丸體細胞的影響
        1.3 睪丸熱應(yīng)激的主要來源
            1.3.1 生活方式和行為因素
            1.3.2 職業(yè)與環(huán)境因素
            1.3.3 病理性臨床因素
        1.4 熱應(yīng)激誘發(fā)睪丸生殖細胞損傷的機制
            1.4.1 凋亡途徑
            1.4.2 自噬途徑
            1.4.3 DNA損傷途徑
            1.4.4 氧化應(yīng)激途徑
            1.4.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑
        1.5 本研究的目的與意義
試驗部分
    第二章 單次熱應(yīng)激誘發(fā)生殖細胞損傷的劑量效應(yīng)
        2.1 材料和方法
            2.1.1 實驗動物
            2.1.2 主要試劑
            2.1.3 主要儀器及耗材
        2.2 試驗步驟
            2.2.1 小鼠陰囊單次熱應(yīng)激
            2.2.2 小鼠睪丸石蠟包埋
            2.2.3 組織切片蘇木精-伊紅(H&E)染色
            2.2.4 小鼠睪丸組織蛋白提取
            2.2.5 透射電鏡包埋及制片
            2.2.6 組織切片免疫熒光染色
            2.2.7 脂質(zhì)氧化(MDA)檢測
            2.2.8 過氧化氫(H₂O₂)含量檢測
            2.2.9 過氧化氫酶(CAT)活性檢測
            2.2.10 超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測
            2.2.11 蛋白免疫印記(Western Blot)
            2.2.12 組織切片TUNEL檢測
            2.2.13 統(tǒng)計分析
        2.3 試驗結(jié)果
            2.3.1 單次熱應(yīng)激對睪丸形態(tài)學(xué)變化的影響
            2.3.2 單次熱應(yīng)激后睪丸內(nèi)氧化應(yīng)激指標的影響
            2.3.3 單次熱應(yīng)激后睪丸凋亡及自噬相關(guān)蛋白的Western Blot檢測
            2.3.4 單次熱應(yīng)激后透射電鏡觀察小鼠睪丸生殖細胞亞細胞結(jié)構(gòu)變化
            2.3.5 免疫熒光驗證熱應(yīng)激后睪丸內(nèi)的自噬與凋亡表型。
            2.3.6 單次熱應(yīng)激后睪丸內(nèi)HSPA2蛋白的變化特點
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 褪黑素對睪丸熱應(yīng)激損傷的預(yù)防作用
        3.1 材料和方法
            3.1.1 主要試劑
            3.1.2 主要儀器及耗材
        3.2 實驗步驟
            3.2.1 動物處理
            3.2.2 小鼠睪丸組織包埋
            3.2.3 睪丸組織H&E染色
            3.2.4 免疫組化染色
            3.2.5 TUNEL染色
            3.2.6 Western Blot
            3.2.7 氧化應(yīng)激指標檢測
            3.2.8 統(tǒng)計分析
        3.3 試驗結(jié)果
            3.3.1 褪黑素預(yù)防42℃熱應(yīng)激引發(fā)的生精上皮損傷的表型檢查
            3.3.2 HSPA2和TUNEL檢測褪黑素對睪丸42℃熱應(yīng)激的凋亡抑制作用
            3.3.3 褪黑素預(yù)處理在睪丸42℃熱應(yīng)激中的抗氧化應(yīng)激作用
            3.3.4 MAPK應(yīng)激通路在褪黑素預(yù)防睪丸熱應(yīng)激損傷中的作用
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 褪黑素對睪丸熱應(yīng)激損傷的治療作用
        4.1 材料和方法
            4.1.1 主要試劑
            4.1.2 主要儀器及耗材
        4.2 實驗步驟
            4.2.1 動物處理
            4.2.2 小鼠睪丸組織包埋
            4.2.3 睪丸組織H&E染色
            4.3.4 睪丸生理指標的計算
            4.2.5 免疫組化染色
            4.2.6 統(tǒng)計分析
        4.3 試驗結(jié)果
            4.3.1 褪黑素對睪丸42℃熱應(yīng)激損傷的治療效果評估
            4.3.2 褪黑素對睪丸熱應(yīng)激后支持細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的保護作用
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 隱睪誘發(fā)睪丸生殖細胞損傷的機制
        5.1 材料和方法
            5.1.1 主要試劑
            5.1.2 主要儀器及耗材
        5.2 試驗步驟
            5.2.1 手術(shù)型隱睪小鼠模型的建立
            5.2.2 睪丸組織包埋及切片染色及免疫組化
            5.2.3 睪丸細胞的分離
            5.2.4 睪丸單細胞轉(zhuǎn)錄組測序
            5.2.5 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 隱睪引起精子發(fā)生受阻
            5.3.2 隱睪抑制精原細胞分化
            5.3.3 睪丸單細胞轉(zhuǎn)錄組測序細胞群分析
            5.3.4 隱睪導(dǎo)致睪丸內(nèi)細胞類群比例變化
            5.3.5 隱睪誘發(fā)分化精原細胞基因表達模式發(fā)生變化
            5.3.6 隱睪引起精原細胞分化阻滯
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
結(jié)論
創(chuàng)新點
后續(xù)研究工作
參考文獻
致謝
個人簡歷



本文編號：3822057