發(fā)布時(shí)間：2023-05-13 01:34

　　綠盲蝽寄主范圍廣泛,可以危害林木、果樹(shù)和多種經(jīng)濟(jì)作物。昆蟲(chóng)蛻皮激素(20E)信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究現(xiàn)已成為昆蟲(chóng)學(xué)研究的熱點(diǎn),磷脂酶C(Phospholipases C,PLC)參與調(diào)節(jié)多種激素和神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),但其基因特征及在綠盲蝽(Apolygus lucorum)20E信號(hào)傳導(dǎo)中的功能尚不清晰。E75是20E信號(hào)通路重要的下游應(yīng)答基因,該基因的生物學(xué)特性及其在20E調(diào)控綠盲蝽繁殖中的功能尚不明確。因此,本論文采用iTRAQ分析、RACE、RNAi等研究手段,分析綠盲蝽20E信號(hào)通路中的PLC、E75的生化特征,并對(duì)其在20E信號(hào)傳導(dǎo)中的功能進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:1.為在蛋白質(zhì)組學(xué)層面闡明PLC可介導(dǎo)20E信號(hào)通路的傳遞,采用iTRAQ法對(duì)四種不同處理(20E、20E+U73122、U73122和丙酮)的綠盲蝽中腸溫育樣本進(jìn)行了分析,明確了PLC參與了20E信號(hào)傳導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)20E處理與丙酮相比有差異表達(dá)的蛋白達(dá)100種,其中19種蛋白表達(dá)上調(diào),81種蛋白表達(dá)下調(diào);磷脂酶抑制劑U73122處理與丙酮處理相比,差異蛋白有261種,其中42種蛋白上調(diào),219種蛋白下調(diào);20E vs丙...

【文章頁(yè)數(shù)】：102 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
第一章 緒論
    1 概述
    2 昆蟲(chóng)蛻皮激素傳導(dǎo)的基因組途徑
    3 蛻皮激素的核受體及其功能
    4 昆蟲(chóng)蛻皮激素傳導(dǎo)的非基因組途徑
    5 PLC生物學(xué)特性及功能
    6 蛻皮激素級(jí)聯(lián)反應(yīng)
        6.1 20E誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子 75
        6.2 20E 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子 74
        6.3 變態(tài)起始因子
    7 同重同位素相對(duì)與絕對(duì)定量(iTRAQ)
    8 研究目的意義和研究?jī)?nèi)容
        8.1 研究意義
        8.2 研究?jī)?nèi)容
第二章 基于i TRAQ分析綠盲蝽磷脂酶C基因Al PLC在蛻皮激素傳導(dǎo)中的功能
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 供試?yán)ハx(chóng)
        2.2 樣品準(zhǔn)備
        2.3 蛋白質(zhì)提取和消化
        2.4 iTRAQ標(biāo)簽
        2.5 高pH Reversce反相分配色譜法分離
        2.6 LC-ESI-MS/質(zhì)譜分析
        2.7 iTRAQ蛋白質(zhì)鑒定和定量
        2.8 生物信息學(xué)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 20 E處理綠盲蝽后不同差異蛋白表達(dá)分析
        3.2 磷酯酶C抑制劑處理后綠盲蝽后不同差異蛋白表達(dá)的分析
        3.3 20 E和 U73122 處理綠盲蝽后共同差異蛋白表達(dá)分析
        3.4 20 E、U73122和20E+U73122 處理綠盲蝽后差異蛋白表達(dá)分析
    4 結(jié)論與討論
第三章 綠盲蝽磷脂酶C基因Al PLCγ的克隆、表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及單克隆抗體的制備
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 供試?yán)ハx(chóng)
        2.2 綠盲蝽總RNA的分離及cDNA第一鏈的合成
        2.3 Al PLCγ基因5’端序列的克隆
        2.4 Al PLCγ基因3’端序列的克隆
        2.5 Al PLCγ基因全長(zhǎng)的拼接
        2.6 不同日齡綠盲蝽總RNA的提取及cDNA的合成
        2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        2.8 Northern Blot分析
        2.9 表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.10 融合蛋白的原核誘導(dǎo)表達(dá)
        2.11 融合蛋白的變復(fù)性
        2.12 融合蛋白的Ni柱親和純化
        2.13 重組AlPLCγ蛋白的酶學(xué)特性
        2.14 AlPLCγ單克隆抗體的制備
            2.14.1 免疫
            2.14.2 建立雜交瘤細(xì)胞株
            2.14.3 制備腹水
            2.14.4 抗體的純化
            2.14.5 Western-blot檢測(cè)單克隆抗體的特異性
        2.15 數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 綠盲蝽AlPLCγ基因的克隆及序列分析
        3.2 綠盲蝽AlPLCγ基因的系統(tǒng)發(fā)育分析
        3.3 綠盲蝽AlPLCγ基因表達(dá)特性分析
        3.4 重組AlPLCγ的表達(dá)、復(fù)性及純化
        3.5 重組蛋白AlPLCγ磷脂酶活力的檢測(cè)
        3.6 不同溫度下重組蛋白AlPLCγ的酶活測(cè)定
        3.7 不同pH下重組AlPLCγ蛋白的酶活測(cè)定
        3.8 AlPLCγ單克隆抗體的制備與特異性檢測(cè)
    4 結(jié)論與討論
第四章 綠盲蝽AlPLCγ對(duì)20E下游應(yīng)答基因表達(dá)的影響
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 供試?yán)ハx(chóng)
        2.2 樣品處理
        2.3 AlPLCγ酶活、mRNA表達(dá)量及蛋白含量
        2.4 第二信使IP₃ 分析
        2.5 第二信使DAG含量
        2.6 綠盲蝽蛻皮激素響應(yīng)基因mRNA表達(dá)量的分析
        2.7 數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 不同處理對(duì)綠盲蝽AlPLCγ酶活性、基因mRNA表達(dá)量的影響
        3.2 不同處理對(duì)綠盲蝽AlPLCγ蛋白含量的影響
        3.3 不同處理對(duì)第二信使IP₃和DAG含量的影響
        3.4 不同處理對(duì)20E下游應(yīng)答基因mRNA表達(dá)量的影響
    4 結(jié)論與討論
第五章 蛻皮激素受體E75在綠盲蝽繁殖中的功能
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 供試?yán)ハx(chóng)
        2.2 Al E75A基因克隆
        2.3 體外翻譯
        2.4 Al E75A基因mRNA表達(dá)譜
        2.5 Northern Blot分析
        2.6 siRNA注射
        2.7 RNAi效果檢測(cè)
        2.8 Western blot分析
        2.9 Al Vg表達(dá)譜分析
        2.10 20 E處理
        2.11 統(tǒng)計(jì)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 綠盲蝽Al E75A基因全長(zhǎng)序列特征
        3.2 AlE75A表達(dá)譜分析
        3.3 體內(nèi)敲除AlE75A基因?qū)Ψ敝沉Φ挠绊?br>        3.4 20 E對(duì)綠盲蝽AlVg基因表達(dá)量的影響
        3.5 AlE75A RNAi對(duì) AlVg基因表達(dá)的影響
        3.6 AlE75A RNAi對(duì)AlVg蛋白水平的影響
    4 結(jié)論與討論
第六章 綠盲蝽蛻皮激素響應(yīng)基因E75D的克隆及表達(dá)特性
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 供試?yán)ハx(chóng)
        2.2 綠盲蝽Al E75D全長(zhǎng)基因的克隆
        2.3 熒光定量PCR反應(yīng)
        2.4 AlE75D基因在大腸桿菌Arctic Express中的表達(dá)
        2.5 重組AlE75D蛋白的純化
        2.6 單克隆抗體的制備
            2.6.1 免疫
            2.6.2 建立雜交瘤細(xì)胞株
            2.6.3 制備腹水
        2.7 單克隆抗體的鑒定
            2.7.1 抗體的純化
            2.7.2 Western-blot檢測(cè)單克隆抗體的特異性
        2.8 數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 AlE75D的克隆與序列分析
        3.2 AlE75D基因的表達(dá)特性
        3.3 AlE75D的原核表達(dá)
        3.4 重組蛋白的Ni柱親和純化
        3.5 抗AlE75D蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立
        3.6 AlE75D蛋白單克隆抗體的特異性鑒定
    4 結(jié)論與討論
第七章 全文總結(jié)
    1 主要研究結(jié)果
        1.1 iTRAQ法明確了PLC可參與綠盲蝽蛻皮激素信號(hào)的傳導(dǎo)
        1.2 明確了綠盲蝽Al PLCγ的生化特征
        1.3 闡明了Al PLCγ在20E及U73122誘導(dǎo)下的應(yīng)答反應(yīng)
        1.4 明確了綠盲蝽E75在20E調(diào)控綠盲蝽繁殖中的功能
    2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
    3 不足與展望
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
附表
參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：3815031