軟體動物殼是一種迷人的生物礦物質,它由高度有序的碳酸鈣復合物組成。研究表明,它的貝殼在損壞后可以進行修復再生。該修復過程與貝殼的生長過程類似,均受到生物大分子,尤其是貝殼基質蛋白(SMP)來調(diào)節(jié)�；|蛋白Shematrin-2,其表達水平在外套膜組織中最高,其含量在合浦珠母貝的貝殼中最高,已被認為是生物礦化的關鍵參與者,但對其功能及調(diào)節(jié)機制知之甚少。在本論文中,我們利用蛋白質組學的方法,鑒定了合浦珠母貝貝殼損傷5-20天修復再生的貝殼的SMPs,并比較了新生貝殼與成熟貝殼之間的微觀結構差異。雖然新生的貝殼晶型是方解石,但與再生過程中新生貝殼的微觀結構不同,這可以模擬胚胎幼貝發(fā)育過程中貝殼的形成過程。此外,我們從新生的貝殼中發(fā)現(xiàn)了49個SMPs,包括僅存在于成熟的珍珠層中的一些蛋白質。另一方面,新生貝殼的基質蛋白還能夠在體外影響Ca CO₃晶體形貌,降低晶體的結晶度。這部分工作可以加深我們對貝殼形成過程的認識。此外,我們在體外表達并純化了基質蛋白Shematrin-2,并探討了其轉錄調(diào)控的功能和機制。體外功能實驗表明,Shematrin-2可以結合貝殼的方解石、文石...

【文章頁數(shù)】：125 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
主要英文縮略詞對照表
第1章 前言
    1.1 問題的提出
    1.2 選題背景及意義
    1.3 文獻綜述
        1.3.1 生物礦化概述
        1.3.2 軟體動物的貝殼結構
        1.3.3 軟體動物的礦化系統(tǒng)
        1.3.4 貝殼的修復再生
        1.3.5 合浦珠母貝中基質蛋白的研究進展
        1.3.6 合浦珠母貝中基質蛋白轉錄調(diào)控的研究進展
    1.4 論文研究方法
    1.5 論文結構
第2章 實驗材料與方法
    2.1 實驗動物
    2.2 貝殼再生模型的構建
    2.3 貝殼基質蛋白的提取
    2.4 貝殼間液蛋白的提取
    2.5 蛋白濃度的測定
    2.6 蛋白的質譜(LC-MS/MS)
    2.7 Unigene注釋和分類
    2.8 體外結晶實驗
    2.9 蛋白與文石、方結石和幾丁質的結合實驗
    2.10 結晶速率實驗
    2.11 ACC相轉實驗
    2.12 晶型鑒定與形貌觀察
        2.12.1 Raman光譜分析
        2.12.2 X射線衍射(XRD)
        2.12.3 掃描電子顯微鏡觀察(SEM)
        2.12.4 透射電子顯微鏡觀察(TEM)
        2.12.5 原子力顯微鏡觀察(AFM)
    2.13 RNA的提取
    2.14 轉錄因子cDNA全長的克隆
        2.14.1 RACE c DNA模板的準備
        2.14.2 轉錄因子的RACE引物
        2.14.3 轉錄因子的RACE
        2.14.4 目的片段回收、連接、轉化及鑒定
        2.14.5 轉錄因子全長的鑒定
    2.15 序列分析
    2.16 組織分布及胚胎發(fā)育時期表達分布檢測
        2.16.1 組織分布檢測
        2.16.2 胚胎發(fā)育過程中基因的表達分布檢測
    2.17 基因組DNA提取
    2.18 基質蛋白Shematrin-2 基因啟動子的克隆
    2.19 細胞培養(yǎng)
    2.20 載體的構建
    2.21 細胞轉染
    2.22 雙熒光素酶活性的測定
        2.22.1 裂解細胞
        2.22.2 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的檢測
    2.23 轉錄因子在細胞中的亞定位
    2.24 多克隆抗體的制備
        2.24.1 Shematrin-2 蛋白的獲取及純化
        2.24.2 Shematrin-2 多克隆抗體的獲取及純化
    2.25 Shematrin-2 抗體抑制實驗
    2.26 Shematrin-2 的表達與純化
    2.27 貝殼損傷修復
    2.28 RNA干擾實驗
        2.28.1 dsRNA的合成和純化
        2.28.2 dsRNA的注射及后期檢測、觀察
    2.29 數(shù)據(jù)處理與分析
第3章 貝殼損傷修復過程的探究
    3.1 合浦珠母貝貝殼的再生過程
    3.2 合浦珠母貝貝殼再生過程的微觀結構
        3.2.1 SEM觀察合浦珠母貝貝殼再生的過程
        3.2.2 TEM觀察合浦珠母貝貝殼再生的過程
        3.2.3 AFM觀察合浦珠母貝貝殼再生的過程
        3.2.4 合浦珠母貝貝殼再生過程的生長模型
    3.3 合浦珠母貝貝殼再生過程的有機框架結構
    3.4 新生貝殼的基質蛋白及其功能
        3.4.1 新生貝殼基質蛋白對碳酸鈣晶貌的影響
        3.4.2 新生貝殼基質蛋白對碳酸鈣晶型的影響
        3.4.3 新生貝殼基質蛋白的分析
    3.5 討論
    3.6 小結
第4章 基質蛋白Shematrin-2 在生物礦化中的功能研究
    4.1 Shematrin-2 的分布、表達和純化
    4.2 Shematrin-2 與文石、方解石和幾丁質的結合特性
    4.3 Shematrin-2 在貝殼形成中的作用
    4.4 在貝殼損傷修復中Shematrin-2 基因的表達變化
    4.5 Shematrin-2對ACC向穩(wěn)定晶型轉變的影響
    4.6 Shematrin-2 對碳酸鈣沉積速率的影響
    4.7 Shematrin-2 對碳酸鈣結晶的影響
    4.8 討論
    4.9 小結
第5章 Shematrin-2 基因的轉錄調(diào)控研究
    5.1 Shematrin-2 基因啟動子的克隆及其轉錄活性的檢測
    5.2 轉錄因子C/EBPs和 NF-Ys的克隆
    5.3 不同組織中Pf-C/EBPs和 Pf-NF-Ys的表達分布
    5.4 不同胚胎幼體發(fā)育時期Pf-C/EBPs和 Pf-NF-Ys的表達分布
    5.5 Pf-C/EBP-A和 Pf-C/EBP-B在 HEK-293T細胞中的定位
    5.6 Pf-C/EBP-A和 Pf-C/EBP-B對 Shematrin-2 基因的轉錄調(diào)控
    5.7 Pf-C/EBP-A和 Pf-C/EBP-B對 Shematrin-2 的體內(nèi)調(diào)控作用
    5.8 討論
    5.9 小結
第6章 總結與展望
    6.1 論文總結
    6.2 論文展望
        6.2.1 貝殼再生過程中分子機理的探究
        6.2.2 貝殼形成模型的進一步探究
        6.2.3 對貝殼轉錄調(diào)控機理的探討
參考文獻
致謝
聲明
個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果



本文編號：3814298