坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)是近年來出現(xiàn)在我國的一種新發(fā)傳染病病原,屬于黃病毒科、黃病毒屬成員,具有傳播迅速,宿主范圍廣泛,跨種間傳播等特點。TMUV是目前已知唯一對鴨致病的黃病毒,感染成鴨后主要侵害生殖系統(tǒng),引發(fā)產(chǎn)蛋量的急劇下降,是威脅我國養(yǎng)鴨業(yè)的重要病原。宿主免疫細胞是黃病毒屬病毒的重要靶細胞,兩者間存在著廣泛的相互作用。然而,目前的研究主要集中在登革熱病毒和寨卡病毒等病原,對TMUV與宿主免疫細胞間的互作卻鮮有報道。為探索TMUV感染過程中不同免疫細胞對其增殖能力的影響,本研究分別利用細胞差數(shù)分選法和流式細胞儀分選法純化富集外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中不同細胞亞群,并檢測在體內(nèi)和體外條件下TMUV對PBMC各亞群細胞的感染情況,發(fā)現(xiàn)TMUV對PBMC中的單核吞噬細胞系統(tǒng)(Mononuclear phagocytic system,MPS)具有顯著的偏嗜性。本研究進一步利用單核巨噬細胞體內(nèi)清除劑Clodronate lipsomes清除SPF雞/鴨MPS,發(fā)現(xiàn)清除MPS能夠顯著降低無特定病...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 坦布蘇病毒
        1.1.1 坦布蘇病毒的病原學(xué)研究進展
        1.1.2 TMUV的流行病學(xué)研究進展
        1.1.3 TMUV的診斷與預(yù)防研究進展
    1.2 單核吞噬細胞系統(tǒng)(MPS)與病毒相互作用研究進展
        1.2.1 MPS在病毒增殖中的作用
        1.2.2 病毒感染對MPS功能的影響
    1.3 MPS的氧化還原系統(tǒng)
        1.3.1 呼吸爆發(fā)作用
        1.3.2 一氧化氮(NO)
        1.3.3 轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)
    1.4 本研究目的意義
第二章 TMUV對禽MPS偏嗜性的研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 病毒株和細胞系
        2.1.2 實驗動物
        2.1.3 主要試驗試劑
        2.1.4 其他試劑及配置
        2.1.5 試驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 病毒擴繁及毒價測定
        2.2.2 SPF雞/鴨外周血單個核細胞(PBMC)的分離
        2.2.3 差數(shù)分離法分離PBMC
        2.2.4 差數(shù)分離法分離MPS的純度檢測
        2.2.5 RT-qPCR檢測TMUV增殖
        2.2.6 流式細胞儀分選PBMC
        2.2.7 動物感染實驗
        2.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 TMUV體外感染SPF雞 /鴨PBMC時對貼壁細胞具有偏嗜性
        2.3.2 差數(shù)貼壁法分離MPS純度的檢測
        2.3.3 TMUV體外感染SPF雞PBMC時對MPS具有偏嗜性
        2.3.4 TMUV體內(nèi)感染SPF雞/鴨PBMC時對MPS/貼壁細胞具有偏嗜性
        2.3.5 清除SPF雞體內(nèi)MPS能夠有效抑制TMUV的感染
        2.3.6 清除SPF鴨體內(nèi)MPS能夠有效抑制TMUV的感染
    2.4 討論
第三章 TMUV感染HD11細胞系對IFN-Ⅰ信號通路的影響
    3.1 實驗材料
        3.1.1 病毒株和細胞系
        3.1.2 主要試驗試劑
        3.1.3 其他試劑及配置
        3.1.4 試驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 測定TMUV在HD11上的生長曲線
        3.2.2 Western blot檢測TMUV在HD11中增殖情況
        3.2.3 RNA-seq樣品制備
        3.2.4 高通量測序及數(shù)據(jù)分析
        3.2.5 ELISA檢測細胞因子含量
        3.2.6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測IFN-β
        3.2.7 提取核糖體新生肽鏈復(fù)合物RNA(RNC-RNA)并利用RT-qPCR檢測IFN-β表達量
        3.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 TMUV在HD11上的增殖情況鑒定
        3.3.2 RNA-seq結(jié)果分析
        3.3.3 IFN-α/β抑制TMUV增 殖
        3.3.4 TMUV感染對IF N-α/β具有不同的影響
        3.3.5 TMUV感染不影響IFN-β的釋放過程
        3.3.6 TMUV感染不影響IFN-β的翻譯起始過程
        3.3.7 TMUV感染促進IFN-β的降解
        3.3.8 TMUV感染不影響部分禽源干擾素刺激基因(chISGs)的產(chǎn)生
    3.4 討論
第四章 TMUV感染HD11細胞系后對呼吸爆發(fā)反應(yīng)的影響
    4.1 實驗材料
        4.1.1 病毒株、細菌株和細胞系
        4.1.2 主要試驗試劑
        4.1.3 試驗儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 RNA-seq樣品制備及數(shù)據(jù)分析
        4.2.2 NO濃度檢測
        4.2.3 超氧化物檢測
        4.2.4 活性氧(ROS)檢測
        4.2.5 細胞總SOD酶活性檢測
        4.2.6 siRNA敲低Nrf2基因
        4.2.7 激光共聚焦試驗(confocal)
        4.2.8 RT-qPCR檢測Nrf2介導(dǎo)基因的表達
        4.2.9 測定S.pullorum在共感染條件下的增殖情況
        4.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 TMUV感染抑制活性氮(RNS)的產(chǎn)生
        4.3.2 TMUV感染HD11不刺激產(chǎn)生活性氧(ROS)和超氧化物
        4.3.3 TMUV感染抑制ROS和超氧化物的產(chǎn)生
        4.3.4 呼吸爆發(fā)作用抑制TMUV的增殖
        4.3.5 TMUV感染促進S.pullorum在HD11中的增殖
        4.3.6 TMUV感染調(diào)控NADPH氧化酶(NADPH oxidase)各組分基因表達
        4.3.7 TMUV感染提高HD11細胞SOD酶活性
        4.3.8 TMUV感染促進Nrf2介導(dǎo)的抗氧化基因顯著上升
        4.3.9 TMUV感染促進Nrf2蛋白入核
        4.3.10 siRNA敲低Nrf2基因的表達顯著拮抗TMUV對呼吸爆發(fā)作用的抑制作用
        4.3.11 siRNA敲低Nrf2基因的表達拮抗TMUV對SOD酶活性的促進作用
        4.3.12 siRNA敲低Nrf2基因的表達拮抗TMUV對抗氧化基因的激活作用
        4.3.13 siRNA敲低Nrf2基因的表達抑制TMUV的增殖
    4.4 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡歷



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