發(fā)布時(shí)間：2023-03-27 18:23

　　氨氧化古細(xì)菌(AOA)在地球氮循環(huán)中發(fā)揮重要的作用,但其在農(nóng)田及其他生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)氨氧化的貢獻(xiàn),以及在這些生態(tài)系統(tǒng)中所扮演的角色尚不清晰,其中一因素是缺少足夠可供研究的菌株。分離或富集的AOA菌株對(duì)于確認(rèn)不同AOA譜系的生理特性至關(guān)重要,但是AOA富集或分離非常困難且耗時(shí)(平均2至3年),國(guó)內(nèi)外科學(xué)家經(jīng)過(guò)了十幾年的努力只得到了30余個(gè)AOA的培養(yǎng)物,這限制我們對(duì)AOA的認(rèn)識(shí)。從環(huán)境中獲得更多的AOA培養(yǎng)物對(duì)全面探索其在不同環(huán)境中的生態(tài),生理學(xué)和基礎(chǔ)生物化學(xué)具有重要的意義。本研究設(shè)計(jì)了一種從土壤中快速富集Nitrosocosmicus屬AOA的“兩步法”策略。首先,聯(lián)用卡那霉素和氨芐青霉素作為抑制細(xì)菌的選擇壓力,并使用石英砂作為AOA細(xì)胞的附著載體。僅培養(yǎng)40-75天,即可獲得豐度>20%的AOA富集物。在第二步中,選擇環(huán)丙沙星和阿奇霉素的抗生素組合提高AOA的豐度。這兩種抗生素能夠針對(duì)生物膜并殺死聚集物中的細(xì)菌,僅培養(yǎng)一代,AOA在富集物中即可達(dá)高豐度(>90%)。按照兩步法富集策略,在90-150天的富集時(shí)間內(nèi),從農(nóng)田土壤中獲得了3株AOA。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,這些AOA屬于...

【文章頁(yè)數(shù)】：180 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 氮循環(huán)與農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)
        1.1.1 氮循環(huán)
        1.1.2 氮循環(huán)中的微生物
        1.1.3 農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的氮循環(huán)與氮損失
        1.1.4 氮肥損失的危害
        1.1.5 農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的硝化作用與硝化微生物
    1.2 氨氧化古菌(AOA)的發(fā)現(xiàn)及分布
        1.2.1 AOA的發(fā)現(xiàn)過(guò)程——非培養(yǎng)階段
        1.2.2 AOA的發(fā)現(xiàn)過(guò)程——培養(yǎng)階段
        1.2.3 AOA的分布
        1.2.4 土壤中的AOA
    1.3 AOA的分類與特性
        1.3.1 古菌的分類與奇古菌門
        1.3.2 氨氧化古菌的分類
    1.4 AOA的特性
        1.4.1 AOA的生理學(xué)特性
        1.4.2 AOA的基因組
    1.5 氨氧化古菌的研究方法
        1.5.1 基于環(huán)境的調(diào)查與實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)
        1.5.2 系統(tǒng)發(fā)育研究
        1.5.3 基因組研究
        1.5.4 富集以及分離培養(yǎng)
    1.6 研究意義與內(nèi)容
        1.6.1 研究意義
        1.6.2 研究?jī)?nèi)容
第二章 土壤氨氧化古菌的富集策略——兩步法
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 富集土壤樣品
        2.2.2 理化性質(zhì)測(cè)定
        2.2.3 基因組DNA提取
        2.2.4 PCR、克隆及測(cè)序
        2.2.5 擴(kuò)增子測(cè)序
        2.2.6 富集培養(yǎng)
        2.2.7 絕對(duì)定量PCR
        2.2.8 熒光原位雜交(FISH)
        2.2.9 掃描電鏡
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 廣州地區(qū)農(nóng)田土壤AOA群落分析及富集樣品選擇
        2.3.2 不同抗生素對(duì)富集起始階段的影響
        2.3.3 確定AOA富集物的傳代方式
        2.3.4 第一步——快速獲得高濃度的AOA富集物
        2.3.5 第二步——快速獲得高豐度的AOA富集物
        2.3.6 富集物中AOA的鑒定
        2.3.7 兩步富集策略的驗(yàn)證
        2.3.8 兩步富集AOA策略的原理
    2.4 小結(jié)
第三章 Candidatus Nitrosocosmicus agrestis的形態(tài),生理及生化特性研究
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 AOA種子準(zhǔn)備及接種方法
        3.2.2 AOA生理生化實(shí)驗(yàn)
        3.2.3 AOA形態(tài)觀察
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的形態(tài)特征
        3.3.2 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化及生長(zhǎng)特性
        3.3.3 溫度與NaCl濃度對(duì)Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影響
        3.3.4 亞硝酸鹽濃度對(duì)Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影響
        3.3.5 氨氮與pH對(duì)Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影響
        3.3.6 尿素對(duì)Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影響
        3.3.7 氰酸鹽對(duì)Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影響
        3.3.8 有機(jī)碳源對(duì)Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影響
        3.3.9 氨氧化抑制劑對(duì)Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影響
    3.4 小結(jié)
第四章 Candidatus Nitrosocosmicus agrestis基因組的解析
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 SS富集物的宏基因組測(cè)序樣品準(zhǔn)備
        4.2.2 宏基因組文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序
        4.2.3 宏基因組數(shù)據(jù)分析
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 富集物宏基因組DNA樣品的準(zhǔn)備
        4.3.2 宏基因組數(shù)據(jù)處理
        4.3.3 基于ANI及標(biāo)記基因的進(jìn)化分析
        4.3.4 Ca. Nitrosocosmicus agrestis基因組基本信息
        4.3.5 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的代謝途徑及其他功能總覽
        4.3.6 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的能量代謝
        4.3.7 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的謝
        4.3.8 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氮代謝
        4.3.9 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的碳水化合物活性酶(CAZy)
        4.3.10 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
    4.4 小結(jié)
第五章 Candidatus Nitrosocosmicus agrestis的耐氨氮機(jī)制研究
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 不同氨氮濃度下的AOA培養(yǎng)
        5.2.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        5.2.3 相對(duì)熒光定量PCR
        5.2.4 蛋白質(zhì)提取與定量
        5.2.5 培養(yǎng)基上清液中的多胺成分分析
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 基于基因組信息分析Ca. Nitrosocosmicus agrestis的耐氨氮機(jī)制
        5.3.2 氨氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析
        5.3.3 不同氨氮下的能量利用分析
        5.3.4 不同氨氮下的分析多胺釋放量分析
        5.3.5 Ca. Nitrosocosmicus agrestis耐氨氮機(jī)制的生態(tài)意義
    5.4 小結(jié)
結(jié)論與展望
    結(jié)論
    創(chuàng)新之處
    展望
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
附件



本文編號(hào)：3772630