小麥赤霉病是由鐮刀菌引起的一種世界范圍內(nèi)廣泛流行的真菌病害。近年來,由于全球氣候變暖和耕作制度、耕作方式的改變,小麥赤霉病顯現(xiàn)逐年加重和大流行的趨勢(shì),對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。小麥赤霉病主要發(fā)生在穗期,造成穗腐,也可以在苗期引起苗枯、基腐等癥狀,它的發(fā)生不僅造成產(chǎn)量和品質(zhì)的下降,而且產(chǎn)生多種毒素,影響食品安全及人畜健康。培育和推廣抗赤霉病的小麥品種,是控制小麥赤霉病的有效途徑。但是,由于小麥-鐮刀菌互作機(jī)制復(fù)雜,小麥品種天然抗病資源稀少,抗性遺傳基礎(chǔ)狹窄,利用常規(guī)育種培育抗病且綜合性狀優(yōu)良的品種難度較大�；蚬こ逃N技術(shù)的日趨成熟為解決這一難題提供了新的途徑。既可利用小麥天然抗源外,還可以充分利用其他植物、動(dòng)物和微生物的抗病基因資源,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造目標(biāo)性狀突出且綜合性狀優(yōu)良的抗赤霉病新品系,具有廣闊的發(fā)展與應(yīng)用前景。本研究采用基因槍介導(dǎo)的最小表達(dá)框轉(zhuǎn)化法,將來源與抗性機(jī)制不同的抗赤霉病相關(guān)基因?qū)豚嶜?023,揚(yáng)麥158以及揚(yáng)麥15等我國小麥主栽品種,旨在為小麥抗赤霉病轉(zhuǎn)基因育種創(chuàng)造新材料。主要結(jié)果如下:1.以鄭麥9023為受體品種,成功導(dǎo)入了由大麥穎殼特異Lem2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的抗體融...

【文章頁數(shù)】：117 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 研究背景
    1.2 小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展
        1.2.1 小麥遺傳轉(zhuǎn)化的方法
            1.2.1.1 基因槍法
            1.2.1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法
            1.2.1.3 其他轉(zhuǎn)化方法
        1.2.2 篩選標(biāo)記基因的選擇
        1.2.3 基因槍介導(dǎo)的最小表達(dá)框轉(zhuǎn)化法
        1.2.4 如何提高外源基因的高效與穩(wěn)定表達(dá)
            1.2.4.1 轉(zhuǎn)化方法的選擇
            1.2.4.2 不同啟動(dòng)子的應(yīng)用
            1.2.4.3 MAR的應(yīng)用
            1.2.4.4 對(duì)外源基因進(jìn)行優(yōu)化
    1.3 抗赤霉病轉(zhuǎn)基因小麥研究進(jìn)展
    1.4 HIGS技術(shù)在植物真菌病害防治中的應(yīng)用
        1.4.1 HIGS技術(shù)的概念
        1.4.2 HIGS技術(shù)在植物抗真菌病害領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展
        1.4.3 HIGS技術(shù)在植物真菌病害防治的策略
            1.4.3.1 選擇或篩選有效的病原菌靶標(biāo)基因
            1.4.3.2 植物RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建與HIGS轉(zhuǎn)基因植物的獲得
            1.4.3.3 HIGS轉(zhuǎn)基因植物的分子檢測(cè)與抗病性分析
    1.5 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 質(zhì)粒DNA的提取
            2.2.1.1 試劑盒法提取質(zhì)粒DNA
            2.2.1.2 煮沸法提取質(zhì)粒DNA
        2.2.2 最小表達(dá)框的制備
        2.2.3 基因槍法介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化過程
        2.2.4 小麥基因組DNA的提�。–TAB法）
        2.2.5 PCR鑒定
        2.2.6 Southern雜交分析
            2.2.6.1 小麥基因組DNA酶切及電泳
            2.2.6.2 轉(zhuǎn)膜
            2.2.6.3 預(yù)雜交
            2.2.6.4 雜交探針的制備
            2.2.6.5 雜交
            2.2.6.6 洗膜
            2.2.6.7 放射自顯影
        2.2.7 RNA的提取和cDNA逆轉(zhuǎn)錄
            2.2.7.1 Trizol法提取總RNA
            2.2.7.2 去除總RNA中的基因組DNA
            2.2.7.3 cDNA逆轉(zhuǎn)錄
        2.2.8 qRT-PCR分析
        2.2.9 siRNA Northern blot分析
            2.2.9.1 小RNA的提取
            2.2.9.2 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
            2.2.9.3 轉(zhuǎn)膜
            2.2.9.4 預(yù)雜交與雜交
            2.2.9.5 洗膜與放射自顯影
        2.2.10 赤霉病接種鑒定
            2.2.10.1 鐮刀菌孢子5035懸浮液的制備
            2.2.10.2 苗期接種
            2.2.10.3 單花接種
            2.2.10.4 自然感病接種
        2.2.11 毒素測(cè)定
        2.2.12 組織化學(xué)染色與顯微觀察
            2.2.12.1 乳酚藍(lán)染色
            2.2.12.2 Calcofluor White（CFW）染色
        2.2.13 白粉病接種鑒定
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    3.1 Lem2 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Ech42CWP2 提高小麥赤霉病抗性的研究
        3.1.1 pUPL-Ech42CWP2 載體構(gòu)建與最小表達(dá)框的制備
        3.1.2 轉(zhuǎn)Lem2-Ech42CWP2 基因小麥的遺傳轉(zhuǎn)化過程
        3.1.3 轉(zhuǎn)Lem2-Ech42CWP2 基因小麥的分子鑒定
            3.1.3.1 PCR鑒定
            3.1.3.2 Southern blot分析
        3.1.4 外源基因Ech42CWP2 的表達(dá)模式分析
        3.1.5 轉(zhuǎn)Lem2-Ech42CWP2 基因小麥的赤霉病抗性鑒定
            3.1.5.1 單花接種鑒定
            3.1.5.2 自然接種鑒定
            3.1.5.3 毒素測(cè)定
        3.1.6 H13×Z1 和H13×Z4 雜交株系F4 代的赤霉病抗性鑒定
        3.1.7 SA處理與Fg接種對(duì)外源基因Ech42CWP2 表達(dá)水平的影響
        3.1.8 SA處理與Fg接種對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥赤霉病抗性的影響
    3.2 轉(zhuǎn)Ech42，ACE和ZmGC基因小麥的獲得及其赤霉病抗性分析
        3.2.1 轉(zhuǎn)Ech42，ACE和ZmGC基因小麥的獲得
            3.2.1.1 最小表達(dá)框的制備
            3.2.1.2 轉(zhuǎn)Ech42，ACE和ZmGC基因小麥的遺傳轉(zhuǎn)化過程
        3.2.2 轉(zhuǎn)Ech42，ACE和ZmGC基因小麥的分子鑒定
            3.2.2.1 PCR與RT-PCR檢測(cè)
            3.2.2.2 Southern blot分析
        3.2.3 轉(zhuǎn)Ech42，ACE和ZmGC基因小麥抗赤霉病株系的篩選
        3.2.4 轉(zhuǎn)基因株系Y3b-1 的赤霉病抗性分析
            3.2.4.1 單花接種鑒定
            3.2.4.2 自然接種鑒定
            3.2.4.3 毒素測(cè)定
    3.3 轉(zhuǎn)基因株系CZI，SZP和SYP的分子鑒定及其赤霉病抗性分析
        3.3.1 轉(zhuǎn)基因株系CZI的獲得與分子鑒定
            3.3.1.1 pUPL-HvChi CWP2 載體構(gòu)建
            3.3.1.2 最小表達(dá)框的制備與小麥遺傳轉(zhuǎn)化
            3.3.1.3 轉(zhuǎn)基因株系CZI的PCR鑒定與Southern blot分析
        3.3.2 轉(zhuǎn)基因株系SZP和SYP的分子鑒定
        3.3.3 轉(zhuǎn)基因株系CZI，SZP和SYP的赤霉病抗性鑒定
            3.3.3.1 轉(zhuǎn)基因株系SYP的苗期接種鑒定
            3.3.3.2 轉(zhuǎn)基因株系CZI，SZP和SYP的單花接種鑒定
    3.4 以禾谷鐮刀菌Chs3b基因?yàn)榘袠?biāo)的HIGS技術(shù)提高小麥抗赤霉病的研究 .. 63
        3.4.1 轉(zhuǎn)Chs3bRNAi基因小麥的獲得
            3.4.1.1 Chs3bRNAi-1，-3 和 -5 最小表達(dá)框的制備
            3.4.1.2 轉(zhuǎn)Chs3bRNAi基因小麥的遺傳轉(zhuǎn)化過程
        3.4.2 轉(zhuǎn)Chs3bRNAi基因小麥的分子鑒定
            3.4.2.1 PCR鑒定
            3.4.2.2 Southern blot分析
        3.4.3 轉(zhuǎn)Chs3bRNAi基因小麥的赤霉病抗性鑒定
            3.4.3.1 苗期接種鑒定
            3.4.3.2 單花接種鑒定
            3.4.3.3 自然接種鑒定
            3.4.3.4 毒素測(cè)定
        3.4.4 轉(zhuǎn)Chs3bRNAi基因小麥的siRNA分子檢測(cè)
        3.4.5 Fg接種轉(zhuǎn)Chs3bRNAi基因小麥后Chs3b的表達(dá)水平分析
        3.4.6 轉(zhuǎn)Chs3bRNAi基因小麥的白粉病抗性鑒定
4 討論
    4.1 最小表達(dá)框法轉(zhuǎn)化小麥的遺傳與表達(dá)規(guī)律分析
        4.1.1 轉(zhuǎn)基因的遺傳穩(wěn)定性
        4.1.2 轉(zhuǎn)基因的沉默現(xiàn)象
    4.2 啟動(dòng)子在植物基因工程中的應(yīng)用
        4.2.1 Lem2 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Ech42CWP2 基因提高小麥赤霉病抗性
        4.2.2 不同類型啟動(dòng)子在植物基因工程中的應(yīng)用與展望
    4.3 HIGS技術(shù)在防治植物真菌病害中的應(yīng)用
        4.3.1 針對(duì)Fg的Chs3b基因?yàn)榘袠?biāo)的HIGS技術(shù)提高小麥赤霉病抗性
        4.3.2 HIGS技術(shù)在防治植物真菌病害中的應(yīng)用前景
    4.4 植物抗病轉(zhuǎn)基因育種的展望
        4.4.1 充分挖掘和利用新的抗病基因資源
        4.4.2 分離與克隆不同類型的啟動(dòng)子
        4.4.3 創(chuàng)新與優(yōu)化小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系
        4.4.4 抗病轉(zhuǎn)基因新技術(shù)新方法的創(chuàng)制
參考文獻(xiàn)
附錄：攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文與專利申請(qǐng)情況
致謝



本文編號(hào)：3769639