非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是核質(zhì)巨D(zhuǎn)NA病毒,可感染家豬和歐洲野豬等,其發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%。自2018年8月我國(guó)出現(xiàn)首例非洲豬瘟(African swine fever,ASF)病例,疫情目前已經(jīng)蔓延至31個(gè)省份或地區(qū),防控形勢(shì)嚴(yán)峻。ASFV擁有龐大的基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制,使得該病仍未有商品化疫苗問(wèn)世。環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(Cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)是近期發(fā)現(xiàn)的DNA胞質(zhì)模式識(shí)別受體,在激活宿主天然免疫、調(diào)控適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用。cGAS能夠識(shí)別并結(jié)合存在于胞質(zhì)中DNA,催化合成環(huán)化GMP-AMP(cyclic GMP-AMP,cGAMP),后者結(jié)合并活化干擾素刺激因子(Stimulator of interferon gene,STING),STING招募TBK1激活I(lǐng)RF3和NF-κB,介導(dǎo)Ⅰ型干擾素和促炎性因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。cGAS-STING介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)是研究熱點(diǎn)之一,本文初步篩選具有抑制cGAS-STING信號(hào)通路功能的ASFV蛋白并探討其作用機(jī)制,為研發(fā)安全有效的AS...

【文章頁(yè)數(shù)】：101 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 ASF概述
        1.1.1 非洲豬瘟的流行史
        1.1.2 ASF的傳播特征
    1.2 ASFV概述
    1.3 ASFV免疫逃逸蛋白研究進(jìn)展
        1.3.1 病毒蛋白調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)
        1.3.2 病毒蛋白抑制Ⅰ型干擾素信號(hào)通路及NF-κB信號(hào)通路
        1.3.3 病毒蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡
        1.3.4 病毒其它免疫抑制蛋白
    1.4 cGAS-STING DNA識(shí)別信號(hào)通路
        1.4.1 抗病毒天然免疫
        1.4.2 DNA模式受體及其重要接頭蛋白
        1.4.3 cGAS-STING信號(hào)通路
        1.4.4 病毒逃逸cGAS-STING介導(dǎo)的抗病毒天然免疫
    1.5 研究目的與意義
第二章 ASFV Georgia 2007株多基因家族免疫抑制基因篩選
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)材料
        2.1.2 質(zhì)粒以及質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)材料
        2.1.3 試劑盒
        2.1.4 其他主要材料
        2.1.5 主要儀器
        2.1.6 主要試劑的配置
    2.2 主要方法
        2.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 質(zhì)粒提取
        2.2.3 熒光定量PCR
        2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代
        2.2.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        2.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
        2.2.7 統(tǒng)計(jì)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 ASFV Georgia 2007株MGF360免疫抑制基因的篩選
        2.3.2 ASFV Georgia 2007株MGF505免疫抑制基因的篩選
        2.3.3 ASFV Georgia 2007株MGF110免疫抑制基因的篩選
        2.3.4 ASFV Georgia 2007株MGF100和MGF300免疫抑制基因的篩選
        2.3.5 ASFV-G-ΔMGF缺失MGF360和MGF505免疫抑制基因的篩選
    2.4 討論
第三章 ASFV-SY18 MGF360-12L蛋白對(duì)cGAS-STING信號(hào)通路抑制作用研究
    3.1 材料
        3.1.1 菌株、細(xì)胞和病毒及培養(yǎng)相關(guān)材料
        3.1.2 質(zhì)粒以及質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)材料
        3.1.3 抗體和試劑盒
        3.1.4 SDS-PAGE以及Western-blot相關(guān)試劑
        3.1.5 其他主要材料
        3.1.6 主要儀器
        3.1.7 主要試劑的配置
    3.2 主要方法
        3.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.2 質(zhì)粒提取
        3.2.3 熒光定量PCR
        3.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代
        3.2.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        3.2.6 Western blot分析
        3.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
        3.2.8 VSV-GFP病毒的擴(kuò)增與滴定
        3.2.9 統(tǒng)計(jì)分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 ASFV MGF360-12L抑制cGAS-STING介導(dǎo)IFN-β和NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活
        3.3.2 MGF360-12L抑制TBK1和IRF3-5D誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)
        3.3.3 MGF360-12L抑制TBK1 mRNA水平
        3.3.4 MGF360-12L抑制TBK1和IKKβ介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路
        3.3.5 MGF360-12L抑制IFN-β介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和抗病毒作用
        3.3.6 MGF360-12L抑制IFN-β介導(dǎo)的ISGs表達(dá)
        3.3.7 MGF360-12L免疫抑制功能區(qū)域的鑒定
    3.4 討論
第四章 ASFV-SY18 DP96R蛋白對(duì)CGAS-STING信號(hào)通路抑制作用研究
    4.1 材料
        4.1.1 菌株、細(xì)胞和病毒
        4.1.2 質(zhì)粒以及質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)材料
        4.1.3 主要抗體、試劑及試劑盒
        4.1.4 SDS-PAGE以及Western-blot相關(guān)試劑
        4.1.5 其他主要材料
        4.1.6 主要儀器
        4.1.7 主要試劑的配置
    4.2 方法
        4.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建與提取
        4.2.2 熒光定量PCR
        4.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        4.2.4 病毒抑制試驗(yàn)
        4.2.5 Western blot分析
        4.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
        4.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 DP96R蛋白抑制cGAS/STING介導(dǎo)的IFN-β和NF-κB活化
        4.3.2 DP96R抑制TBK1介導(dǎo)的IFN產(chǎn)生和NF-κB活化
        4.3.3 DP96R抑制TBK1和IKKβ介導(dǎo)NF-κB激活
        4.3.4 DP96R抑制TBK1磷酸化及TBK1介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)
        4.3.5 DP96R蛋白免疫抑制功能結(jié)構(gòu)域的鑒定
    4.4 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3751624