BHD綜合征(Birt-Hogg-Dubésyndrome)是由FLCN(folliculin)基因突變所引起的一種動(dòng)物遺傳疾病�，F(xiàn)有證據(jù)表明FLCN蛋白參與了多種生物過程,包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附、溶酶體和線粒體的生物合成、細(xì)胞能量代謝和營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)等,但缺失FLCN導(dǎo)致BHD綜合征的具體原因仍不清楚。通過對(duì)FLCN蛋白三維結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)其C末端具有一個(gè)DENN結(jié)構(gòu)域,這一結(jié)果提示FLCN可能通過與某些Rab家族蛋白成員發(fā)生作用進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸過程。然而由于對(duì)被運(yùn)輸?shù)呢浳锓肿由腥狈α私?FLCN在囊泡運(yùn)輸中的具體功能還有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)。質(zhì)子協(xié)同氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(proton-assisted amino acid transporter 1,PAT1,又稱SLC36A1)是一個(gè)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布的跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在多種類型的細(xì)胞里,PAT1主要定位在溶酶體表面,PAT1還可以定位在其它部位,包括細(xì)胞膜、偽足,神經(jīng)細(xì)胞的軸突和突觸小泡等。在大鼠平滑肌細(xì)胞,PAT1甚至定位在細(xì)胞核。這些結(jié)果說明PAT1的定位受多種機(jī)制調(diào)控,PAT1在不同細(xì)胞里執(zhí)行的生理功能與其定位有關(guān)。本研究組的...

【文章頁數(shù)】：123 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 FLCN研究進(jìn)展
        1.1.1 FLCN的結(jié)構(gòu)
        1.1.2 FLCN的功能
        1.1.3 FLCN在mTORC1信號(hào)通路中的作用
        1.1.4 FLCN在囊泡運(yùn)輸中的潛在功能
    1.2 氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PAT1研究進(jìn)展
        1.2.1 PAT1的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 PAT1在細(xì)胞內(nèi)的定位
        1.2.3 PAT1在mTORC1信號(hào)通路中的作用
    1.3 Rab蛋白與囊泡運(yùn)輸
        1.3.1 Rab蛋白家族
        1.3.2 Rab蛋白活性的調(diào)控
        1.3.3 Rab蛋白在囊泡運(yùn)輸中的功能
    1.4 Rab11研究進(jìn)展
        1.4.1 Rab11蛋白家族
        1.4.2 Rab11活性調(diào)節(jié)蛋白
        1.4.3 Rab11的效應(yīng)因子
        1.4.4 Rab11在囊泡運(yùn)輸中的功能
    1.5 前期研究發(fā)現(xiàn)及本研究設(shè)想
        1.5.1 前期研究發(fā)現(xiàn)
        1.5.2 本研究設(shè)想
第二章 PAT1在HEK293細(xì)胞內(nèi)的定位及運(yùn)輸途徑
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞、載體和抗體
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 構(gòu)建真核表達(dá)載體
        2.2.2 穩(wěn)定表達(dá)PAT1-3×FLAG細(xì)胞株的構(gòu)建
        2.2.3 細(xì)胞免疫熒光染色檢測myc-PAT1的表達(dá)定位
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
        2.3.2 穩(wěn)定表達(dá)PAT1-3×FLAG細(xì)胞株的Westernblot鑒定
        2.3.3 myc-PAT1與mCherry融合的不同囊泡標(biāo)記蛋白的共定位
        2.3.4 myc-PAT1與內(nèi)源囊泡標(biāo)記蛋白的共定位
        2.3.5 myc-PAT1與TGN38、M6PR、EEA1以及Chmp5蛋白的共定位
        2.3.6 PAT1-3×FLAG的間接運(yùn)輸途徑
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 FLCN對(duì)PAT1在細(xì)胞內(nèi)分布的影響
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞、載體和抗體
        3.1.2 siRNA序列
        3.1.3 主要試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 FLCN對(duì)PAT1溶酶體定位的影響
        3.2.2 FLCN對(duì)PAT1細(xì)胞膜定位的影響
        3.2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測FLCN對(duì)PAT1胞內(nèi)定位的影響
        3.2.4 FLCN對(duì)PAT1調(diào)控mTORC1活性的影響
        3.2.5 熒光定量PCR檢測PAT1siRNA的干擾效率
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 抑制FLCN對(duì)PAT1-3×FLAG溶酶體定位的影響
        3.3.2 抑制FLCN對(duì)PAT1-3×FLAG細(xì)胞膜定位的影響
        3.3.3 細(xì)胞免疫熒光檢測FLCN對(duì)PAT1細(xì)胞內(nèi)定位的影響
        3.3.4 敲除FLCN對(duì)PAT1-3×FLAG溶酶體定位的影響
        3.3.5 敲除FLCN對(duì)PAT1-3×FLAG細(xì)胞膜定位的影響
        3.3.6 FLCN在PAT1過表達(dá)條件下對(duì)mTORC1的影響
        3.3.7 FLCN在抑制PAT1條件下對(duì)mTORC1的影響
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 FLCN與Rab11A存在蛋白與蛋白間相互作用
    4.1 材料
        4.1.1 細(xì)胞、載體和抗體
        4.1.2 主要試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 FLCN(1-340 AA)和FLCN(341-579 AA)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.2 FLCN與Rab5A,Rab7A以及Rab11A的共定位
        4.2.3 蛋白免疫共沉淀(co-IP)
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 FLCN重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果
        4.3.2 FLCN與GFP-Rab5A,GFP-Rab7A以及GFP-Rab11A的共定位分析以及GFP-Rab11A的共定位分析
        4.3.3 FLCN與Rab5A, Rab7A以及Rab11A的co-IP結(jié)果
        4.3.4 mFLCN與鼠源Rab5A,Rab7A以及Rab11A的co-IP結(jié)果
        4.3.5 FLCN通過DENN結(jié)構(gòu)域與GFP-Rab11A結(jié)合
        4.3.6 FLCN可以結(jié)合GFP-Rab11B
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章Rab11A調(diào)控PAT1在溶酶體和細(xì)胞膜上的定位
    5.1 材料
        5.1.1 細(xì)胞、載體和抗體
        5.1.2 Rab11A干擾慢病毒
        5.1.3 主要試劑
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 Rab11A-CA和Rab11A-DN過表達(dá)載體的構(gòu)建
        5.2.2 抑制Rab11A表達(dá)對(duì)PAT1溶酶體和細(xì)胞膜定位的影響
        5.2.3 過表達(dá)Rab11A-DN突變體對(duì)PAT1溶酶體和細(xì)胞膜定位的影響
        5.2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測Rab11A對(duì)PAT1胞內(nèi)定位的影響
        5.2.5 抑制Rab11A對(duì)PAT1蛋白穩(wěn)定性的影響
        5.2.6 Rab11A對(duì)PAT1調(diào)控mTORC1活性的影響
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 Rab11A-CA和Rab11A-DN重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果
        5.3.2 抑制Rab11A表達(dá)促進(jìn)PAT1在溶酶體上定位
        5.3.3 抑制Rab11A表達(dá)抑制PAT1在細(xì)胞膜定位
        5.3.4 過表達(dá)Rab11A-DN(S25N)突變體對(duì)PAT1溶酶體定位的影響
        5.3.5 過表達(dá)Rab11A-DN(S25N)突變體對(duì)PAT1細(xì)胞膜定位的影響
        5.3.6 細(xì)胞免疫熒光檢測Rab11A對(duì)PAT1細(xì)胞內(nèi)定位的影響
        5.3.7 抑制Rab11A促進(jìn)PAT1被溶酶體降解
        5.3.8 Rab11A拮抗PAT1抑制mTORC1的作用
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章FLCN在Rab11A介導(dǎo)的囊泡運(yùn)輸中的功能研究
    6.1 材料
        6.1.1 細(xì)胞、載體和純化蛋白
        6.1.2 抗體和試劑
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 GEF活性檢測實(shí)驗(yàn)
        6.2.2 Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測FLCN與不同形式Rab11A的結(jié)合特異性
        6.2.3 Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測PAT1與Rab5A,Rab7A,Rab11A的結(jié)合情況
        6.2.4 Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測FLCN敲除對(duì)PAT1-Rab11A相互作用的影響
        6.2.5 Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測FLCN敲除對(duì)Tf R-Rab11A相互作用的影響
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 FLCN與Rab11A的活性形式結(jié)合較為緊密
        6.3.2 PAT1-3×FLAG可以結(jié)合Rab5A、Rab7A和Rab11A
        6.3.3 FLCN特異地影響PAT1與Rab11A的結(jié)合
        6.3.4 FLCN促進(jìn)Rab11A與TfR結(jié)合
    6.4 討論
    6.5 小結(jié)
第七章 結(jié)論
創(chuàng)新點(diǎn)
下一步研究計(jì)劃
附錄
縮略詞
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡歷



本文編號(hào)：3740805