脂滴包被蛋白（perilipin,PLIN1）是一種在真核生物中由PLIN1基因編碼的蛋白質(zhì)。PAT家族是與脂滴表面蛋白相關(guān)的蛋白質(zhì)家族。PLIN1的磷酸化對脂肪組織中脂肪代謝有重要作用,在脂肪細(xì)胞中調(diào)節(jié)脂肪分解和脂肪儲存起重要作用。PLIN1包被在脂滴外層,可阻止體內(nèi)脂肪酶進(jìn)入脂滴,如激素敏感性脂肪酶（HSL）和脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）。PLIN1基因?qū)χ痉纸饩哂须p向調(diào)控作用:基礎(chǔ)狀態(tài)下,PLIN1包被于脂滴表面,阻止脂肪酶接觸到脂滴內(nèi)的甘油三酯,從而抑制脂肪分解;能量需求增加時,c AMP-PKA信號通路被激活,PLIN1磷酸化促進(jìn)脂解。為了探究牛PLIN1基因?qū)εＶ炯?xì)胞增殖分化和脂類代謝的調(diào)控作用,本研究以秦川肉牛初生犢牛前體脂肪細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料,通過腺病毒介導(dǎo)過表達(dá)和干擾PLIN1基因的方法,來探討PLIN1基因在調(diào)控牛前體脂肪細(xì)胞增殖分化過程及脂類代謝中作用,主要研究內(nèi)容如下:1、PLIN1基因多態(tài)位點(diǎn)與秦川肉牛生長性狀和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析檢測PLIN1基因在秦川肉牛12個不同組織部位中的表達(dá)量,牛PLIN1基因在皮下脂肪組織中表達(dá)量顯著高于其它組織（p<0.0... 

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【學(xué)位級別】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 脂肪細(xì)胞分化研究進(jìn)展
        1.1.1 脂肪組織和脂肪細(xì)胞概述
        1.1.2 脂肪代謝研究進(jìn)展
        1.1.3 研究脂肪細(xì)胞增殖分化的模型
    1.2 PAT家族研究進(jìn)展
        1.2.1 PLIN1基因研究進(jìn)展
        1.2.2 PLIN2基因研究進(jìn)展
        1.2.3 TIP47基因研究進(jìn)展
        1.2.4 S3-12基因研究進(jìn)展
        1.2.5 非哺乳動物PAT家族蛋白研究進(jìn)展
    1.3 分子標(biāo)記輔助育種
    1.4 真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控及重要轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展
        1.4.1 C/EBPs家族C/EBPβ
        1.4.2 E2F家族E2F1
        1.4.3 PLAG基因家族PLAG1
        1.4.4 Smads家族Smad3
    1.5 多組學(xué)高通量測序研究進(jìn)展
        1.5.1 轉(zhuǎn)錄組測序研究進(jìn)展
        1.5.2 small RNA測序研究進(jìn)展
        1.5.3 miRNA-mRNA聯(lián)合分析研究進(jìn)展
    1.6 脂質(zhì)代謝的重要通路研究進(jìn)展
        1.6.1 AMPK信號通路的組成及調(diào)控機(jī)制
        1.6.2 Wnt信號通路的組成及調(diào)控機(jī)制
        1.6.3 PPAR信號通路的組成及調(diào)控機(jī)制
    1.7 本研究的目的與意義
第二章 PLIN1基因表達(dá)模式及其多態(tài)位點(diǎn)與秦川肉牛生長性狀和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 主要儀器與試劑耗材
        2.2.2 組織樣品及血液采集與冷凍保存
        2.2.3 血樣DNA的提取、組織樣品總RNA的提取和cDNA的合成
        2.2.4 實(shí)時熒光定量qRT-PCR檢測
        2.2.5 數(shù)據(jù)采集
        2.2.6 多態(tài)位點(diǎn)檢測
        2.2.7 多態(tài)位點(diǎn)分型
        2.2.8 數(shù)據(jù)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 組織總RNA電泳檢測
        2.3.2 PLIN1 基因mRNA表達(dá)譜分析
        2.3.3 牛PLIN1基因序列分析
        2.3.4 PLIN1基因序列同源性分析
        2.3.5 PLIN1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹
        2.3.6 PLIN1基因多態(tài)性位點(diǎn)遺傳分析
        2.3.7 PLIN1 基因SNP位點(diǎn)對秦川肉牛肉質(zhì)和生長性狀的影響
        2.3.8 PLIN1基因的連鎖不平衡和單倍型關(guān)聯(lián)分析
        2.3.9 PLIN1 基因SNP單倍型組合對秦川肉牛肉質(zhì)和生長性狀的影響
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 轉(zhuǎn)錄因子E2F1、PLAG1、C/EBPβ和SMAD3對PLIN1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 主要儀器與試劑耗材
        3.2.2 啟動子雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建
        3.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和報告載體的轉(zhuǎn)染
        3.2.4 轉(zhuǎn)錄因子的定點(diǎn)突變與基因干擾
        3.2.5 凝膠阻滯試驗(yàn)(EMSA)
        3.2.6 數(shù)據(jù)分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 PCR擴(kuò)增牛PLIN1 基因啟動子區(qū)域
        3.3.2 重組質(zhì)粒pGL3-PLIN1 Promoter的鑒定
        3.3.4 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測牛PLIN1基因啟動子逐段缺失片段活性
        3.3.5 PLIN1基因核心啟動子區(qū)域關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測和分析
        3.3.6 C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 結(jié)合位點(diǎn)突變對PLIN1 基因啟動子活性影響
        3.3.7 siC/EBPβ,siE2F1,siPLAG1和siSMAD3 對各轉(zhuǎn)錄因子和PLIN1 基因表達(dá)量的影響
        3.3.8 干擾C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 表達(dá)對PLIN1 基因的啟動子活性的影響
        3.3.9 C/EBPβ,E2F1,PLAG1和SMAD3 轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合PLIN1 基因啟動子
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 牛PLIN1基因重組過表達(dá)腺病毒和干擾腺病毒包裝、對牛脂肪細(xì)胞增殖、分化和脂類代謝作用
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 主要儀器與試劑耗材
        4.2.2 實(shí)時熒光定量PCR分析
        4.2.3 PLIN1基因過表達(dá)腺病毒的包裝
        4.2.4 PLIN1基因干擾腺病毒的包裝
        4.2.5 細(xì)胞免疫熒光
        4.2.6 流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期
        4.2.7 細(xì)胞edu染色
        4.2.8 蛋白質(zhì)免疫印跡分析
        4.2.9 油紅O染色
        4.2.10 甘油三酯(TG)測定
        4.2.11 數(shù)據(jù)分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 牛PLIN1 基因CDS區(qū)克隆與鑒定
        4.3.2 牛PLIN1基因過表達(dá)腺病毒載體的構(gòu)建與重組腺病毒包裝
        4.3.3 牛PLIN1基因干擾腺病毒載體的構(gòu)建與重組腺病毒包裝
        4.3.4 PLIN1基因細(xì)胞免疫熒光
        4.3.5 PLIN1基因過表達(dá)和干擾腺病毒的效率檢測
        4.3.6 干擾和過表達(dá)PLIN1基因?qū)εＧ绑w脂肪細(xì)胞增殖的影響
        4.3.7 過表達(dá)和干擾PLIN1基因?qū)εＶ炯?xì)胞分化的影響
        4.3.8 過表達(dá)和干擾PLIN1 對牛脂肪代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平的影響
        4.3.9 過表達(dá)和干擾PLIN1對牛脂肪代謝相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平的影響
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 基于轉(zhuǎn)錄組測序分析PLIN1基因?qū)χ惔x影響及關(guān)鍵基因挖掘
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 主要儀器設(shè)備與試劑耗材
        5.2.2 牛前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)及冷凍保存
        5.2.3 牛前體脂肪細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
        5.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)研究
        5.2.5 實(shí)時熒光定量PCR分析
        5.2.6 數(shù)據(jù)分析
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 牛前體脂肪細(xì)胞總RNA質(zhì)量檢測
        5.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估
        5.3.3 轉(zhuǎn)錄組測序的可變剪切(AS)事件分析
        5.3.4 基因表達(dá)水平及RNA-Seq相關(guān)性分析
        5.3.5 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因篩選
        5.3.6 轉(zhuǎn)錄組測序差異表達(dá)基因的RT-PCR驗(yàn)證
        5.3.7 轉(zhuǎn)錄組差異基因GO富集分析
        5.3.8 轉(zhuǎn)錄組差異基因KEGG富集分析及調(diào)控通路
        5.3.9 轉(zhuǎn)錄組差異基因與脂類代謝相關(guān)的KEGG通路分析
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章 秦川肉牛脂肪細(xì)胞small RNA測序及轉(zhuǎn)錄組測序關(guān)聯(lián)分析
    6.1 前言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 主要儀器設(shè)備與試劑耗材
        6.2.2 牛前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)及冷凍保存
        6.2.3 牛前體脂肪細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
        6.2.4 small RNA測序(small RNA-Seq)研究
        6.2.5 small RNA測序數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析
        6.2.6 數(shù)據(jù)分析
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 small RNA測序結(jié)果分析
        6.3.2 參考序列比對結(jié)果
        6.3.3 miRNA堿基偏好性
        6.3.4 已知miRNA、新mi RNA預(yù)測、ncRNA和 sRNA分類注釋統(tǒng)計的分析
        6.3.5 miRNA表達(dá)及差異分析
        6.3.6 整合分析RNA-seq與 small RNA-seq
    6.4 討論
    6.5 小結(jié)
第七章 結(jié)論
    7.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)論
    7.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    7.3 展望
附錄
參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[4]中國肉牛產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、熱點(diǎn)透析與發(fā)展趨勢及對策[J]. 昝林森,趙春平,劉揚(yáng),劉永峰.  中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報. 2009(05)
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本文編號：3660783