miRNA是植物生長發(fā)育和生理調(diào)控的重要影響因子,逐漸成為培育優(yōu)良籽粒大小和作物產(chǎn)量的新靶標(biāo)。水稻籽粒灌漿速率對籽粒大小及營養(yǎng)物質(zhì)的積累有較大影響。實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明,miR1432在水稻強(qiáng)弱勢粒灌漿中時序性差異表達(dá),本研究利用谷蛋白特異啟動子Gt13a,構(gòu)建了胚乳特異性過表達(dá)miR1432（OXmiR1432）和低表達(dá)miR1432（STTM1432）的轉(zhuǎn)基因材料,通過對miR1432組織表達(dá)模式分析、轉(zhuǎn)基因材料鑒定、籽粒表型分析及灌漿速率和灌漿參數(shù)的擬合等,初步得出miR1432負(fù)向調(diào)控水稻籽粒灌漿充實(shí)的結(jié)論。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)預(yù)測,煙草瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和5’RACE的實(shí)驗(yàn)手段,分析鑒定出miR1432直接調(diào)控的下游靶基因OsACOT。通過對OsACOT抗miR1432轉(zhuǎn)基因材料表型鑒定,共表達(dá)基因分析及轉(zhuǎn)基因植株籽粒中內(nèi)源激素IAA和ABA含量的測定,結(jié)合miR1432轉(zhuǎn)基因材料花后10天胚乳轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析,推測miR1432-OsACOT調(diào)控模式可能通過調(diào)控內(nèi)源激素含量從而影響水稻籽粒灌漿充實(shí),進(jìn)而決定籽粒大小和產(chǎn)量高低。主要研究結(jié)果如下:1、為明確miR1432在水稻發(fā)... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
縮略詞
第一章 緒論
    1.1 選題的目的和意義
    1.2 植物miRNAs的特征、合成及作用機(jī)制
        1.2.1 miRNAs的特征
        1.2.2 miRNAs的合成
        1.2.3 miRNA的作用機(jī)制
    1.3 miRNA在植物中的功能研究
        1.3.1 miRNA與植物形態(tài)建成
        1.3.2 miRNA與植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
        1.3.3 miRNA在植物種子發(fā)育過程中的作用
    1.4 miR1432在植物生長發(fā)育中的研究進(jìn)展
    1.5 �；o酶A硫酯酶研究進(jìn)展
    1.6 研究目的和擬研究內(nèi)容
第二章 miR1432負(fù)調(diào)控水稻籽粒灌漿充實(shí)
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1.2.1 植物葉片DNA提取(CTAB法)
            2.1.2.2 pCAMBIA1301::Gt13a::MIR1432/STTM1432::Nos載體構(gòu)建
            2.1.2.2 OXmiR1432與STTM1432轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
            2.1.2.3 OXmiR1432與STTM1432轉(zhuǎn)基因植株的獲得
            2.1.2.4 植物組織RNA提取
            2.1.2.5 miRNA反轉(zhuǎn)錄(天根Fast King RT Kit with g DNAase:KR116)
            2.1.2.6 Stem_loop熒光定量PCR(天根Talent熒光定量檢測試劑盒FP209)
            2.1.2.7 Southern雜交
            2.1.2.8 Northern雜交
            2.1.2.9 GUS染色
            2.1.2.10 取樣及籽粒干重測量
            2.1.2.11 籽粒特征測定及灌漿參數(shù)擬合
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 miR1432表達(dá)模式分析
        2.2.2 miR1432在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量鑒定及籽粒表型
        2.2.3 miR1432負(fù)向調(diào)控水稻籽粒大小
        2.2.4 miR1432不同轉(zhuǎn)基因株系灌漿參數(shù)擬合
    2.3 小結(jié)與討論
第三章 miR1432下游靶基因的預(yù)測與鑒定
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            3.1.2.1 miR1432靶基因的預(yù)測
            3.1.2.2 基礎(chǔ)載體PHB::MIR1432及PHB::target的構(gòu)建
            3.1.2.3 PHB::MIR1432及PHB::target轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
            3.1.2.4 煙草瞬時轉(zhuǎn)染
            3.1.2.5 RLM-5’RACE(Invitrogen公司:First Choice RLM-RACE Kit, AM1700)
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 生物信息學(xué)預(yù)測miR1432下游靶基因
        3.2.2 預(yù)測靶基因在miR1432轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量
        3.2.3 煙草瞬時轉(zhuǎn)染驗(yàn)證miR1432靶基因
        3.2.4 RLM-5’RACE驗(yàn)證miR1432與靶基因之間切割位點(diǎn)
        3.2.5 miR1432負(fù)向調(diào)控Os ACOT的轉(zhuǎn)錄
    3.3 結(jié)論與討論
第四章 Os ACOT 正向調(diào)控水稻籽粒灌漿充實(shí)
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            4.1.2.1 Os ACOT抗mi R1432切割載體OXm ACOT的構(gòu)建
            4.1.2.2 OXm ACOT轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
            4.1.2.3 OXm ACOT轉(zhuǎn)基因陽性植株的獲得
            4.1.2.4 籽粒 RNA 提�。ㄈ浇� ET121 Transzol Plant）
            4.1.2.5 反轉(zhuǎn)錄
            4.1.2.6 熒光定量PCR
            4.1.2.7 取樣及籽粒千粒重測量
            4.1.2.8 籽粒特征測定及灌漿參數(shù)擬合
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 OXm ACOT轉(zhuǎn)基因材料的鑒定
        4.2.2 Os ACOT正向調(diào)控水稻籽粒大小
        4.2.3 OXm ACOT轉(zhuǎn)基因植株籽粒表型分析
        4.2.4 OXm ACOT灌漿速率測定及灌漿參數(shù)擬合
    4.3 結(jié)論與討論
第五章 miR1432 調(diào)控水稻籽粒灌漿的轉(zhuǎn)錄組分析
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            5.1.2.1 RNA-seq測序
            5.1.2.2 差異表達(dá)基因鑒定和基因功能注釋
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 RNA-seq數(shù)據(jù)驗(yàn)證
        5.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整體分析
        5.2.3 蔗糖-淀粉代謝相關(guān)基因在差異表達(dá)基因中的分析
        5.2.4 生長素合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因在差異表達(dá)基因中的分析
        5.2.5 ABA合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因在差異表達(dá)基因中的分析
    5.3 結(jié)論與討論
第六章 miR1432-Os ACOT調(diào)控水稻籽粒灌漿充實(shí)的生理分子機(jī)制
    6.1 材料與方法
        6.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            6.1.2.1 Os ACOT基因同源性分析
            6.1.2.2 Os ACOT共表達(dá)基因分析
            6.1.2.3 IAA和ABA測定
            6.1.2.4 脂肪酸含量測定
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 OsACOT基因同源性分析
        6.2.2 OsACOT共表達(dá)基因分析
        6.2.3 OsACOT共表達(dá)基因驗(yàn)證
        6.2.4 OsACOT參與中鏈脂肪酸的合成
        6.2.5 miR1432-Os ACOT模塊參與IAA和ABA的合成
    6.3 結(jié)論與討論
第七章 總結(jié)和下一步研究計劃
    7.1 主要研究結(jié)論
    7.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    7.3 下一步研究計劃
參考文獻(xiàn)
附表
英文摘要
博士期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]植物逆境脅迫相關(guān)miRNA研究進(jìn)展[J]. 王維,張玉娟,陳潔,劉聚波,夏民旋,沈法富.  生物技術(shù)通報. 2015(01)
[2]植物逆境microRNA的研究進(jìn)展[J]. 艾佳,李永光,王濤,宋北光,楊德光,李文濱.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2014(05)
[3]植物miRNA抗逆性研究進(jìn)展[J]. 馬風(fēng)勇,朱永興,石曉霞,許興.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2012(05)
[4]植物microRNA與逆境響應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 許振華,謝傳曉.  遺傳. 2010(10)
[5]Plant fertility defects induced by the enhanced expression of microRNA167[J]. Peng Ru~1 Lin Xu~1 Hong Ma~(2,3) Hai Huang~(1,2) ~1National Laboratory of Plant Molecular Genetics,Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology,Shanghai Institute for Biological Sciences,300 Fenglin Road,Shanghai 200032,China;~2SIBS-SJTU-PSU Joint Center for Life Sciences,Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecologgy,Shanghai Institute for Biological Sciences,300 Fenglin Road,Shanghai 200032,China;~3Department of Biology and the Huck Institute for the Life Sciences,The Pennsylvania State University,University Park,PA 16802,USA.  Cell Research. 2006(05)



本文編號：3631983