發(fā)布時間：2017-05-12 14:10

  本文關(guān)鍵詞：TALE切口酶介導SP110基因定點敲入生產(chǎn)抗結(jié)核病轉(zhuǎn)基因牛的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核病是一種由結(jié)核分支桿菌在人與動物或者人與人之間傳播引起的人畜共患病。牛結(jié)核病在全世界范圍內(nèi)傳播嚴重的影響了人類健康和農(nóng)業(yè)發(fā)展,特別是在亞洲和非洲的一些發(fā)展中國家,由于沒有有效的政策和方案來消除或控制,結(jié)核病的危害尤其嚴重。因此控制和抵御結(jié)核菌傳播的研究變的緊迫和重要。有文獻報道小鼠SP110基因可以控制結(jié)核桿菌的生長并且誘導感染細胞凋亡,本研究的前期工作也確認SP110基因可以增強牛巨噬細胞的抗結(jié)核菌功能。因此本研究旨在通過TALE核酸切口酶在荷斯坦奶牛基因組上定點插入SP110基因,生產(chǎn)具有抵抗結(jié)核桿菌侵染功能的轉(zhuǎn)基因牛�；蚪M編程酶TALEN能夠在精確位點對基因組進行切割,因此被廣泛用于基因功能研究以及轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)。在過去的兩年中,TALEN介導的基因敲除已有大量文獻報道,但是基因敲入成功的例子卻非常少;TALEN介導的基因組修飾已成功應用于多種模式動物并生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物,但是尚未見有TALEN介導基因敲入的轉(zhuǎn)基因牛報道。本研究首次利用TALE核酸切口酶在�；蚪M上進行基因敲入,并生產(chǎn)出13頭SP110基因定點敲入的轉(zhuǎn)基因牛。通過體外攻菌證明轉(zhuǎn)基因牛巨噬細胞可以控制結(jié)核桿菌的生長和增殖,結(jié)核桿菌侵染的轉(zhuǎn)基因細胞會啟動凋亡途徑而不是壞死途徑;通過體內(nèi)攻菌以及細菌傳染試驗證明轉(zhuǎn)基因�？梢杂行У牡钟Y(jié)核桿菌的侵染。本研究的主要內(nèi)容如下所示:1.針對牛28號染色體的表面活化蛋白A1(SFTPA1)和甲硫氨酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶I A(MAT1A)的基因間序列設(shè)計3對特異性的TALENs。使用熒光素酶單鏈退火實驗在人的293-FT細胞中對TALENs的切割活性進行的了初步鑒定。隨后用Surveyor酶切實驗在牛的胎兒成纖維細胞中進行了進一步檢測,以DNA切割后發(fā)生非同源末端連接修復的比率來表征TALENs的切割活性,結(jié)果表明所設(shè)計的三對TALENs中,第二對TALEN的切割活性最高。2.在野生型TALEN右臂的FokI酶中引入一個點突變(第450位天冬氨酸突變?yōu)楸彼?,該點突變可以消除右臂FokI的酶切活性,但不影響TALEN二聚化以及DNA序列的識別,從而構(gòu)建TALE核酸切口酶系統(tǒng)。DNA體外切割試驗證明了該系統(tǒng)可以在預期的位點造成單鏈斷裂,并具有將DNA修復途徑限定為同源重組的能力。3.獲得SP110定點打靶的陽性細胞克隆。通過junction PCR及Southern blot實驗確認為定點打靶并且篩選出單等位基因打靶的細胞。以此細胞為核供體,通過體細胞核移植生產(chǎn)出13頭SP110基因定點敲入的轉(zhuǎn)基因牛。4.對轉(zhuǎn)基因牛的巨噬細胞進行體外攻菌試驗,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因牛巨噬細胞可以控制結(jié)核桿菌的生長和增殖。利用流式細胞術(shù)分析攻菌后巨噬細胞的凋亡率和壞死率,發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌侵染的普通巨噬細胞會啟動壞死途徑,而轉(zhuǎn)基因牛巨噬細胞則會啟動凋亡途徑;使用支氣管點滴法進行體內(nèi)攻菌試驗,尸檢發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因牛臟器的病理得分以及荷菌數(shù)均明顯低于普通牛;通過將轉(zhuǎn)基因牛與結(jié)核病牛在密閉環(huán)境下共同飼養(yǎng)的方法進行模擬傳染試驗,皮試檢測、伽馬干擾素釋放水平檢測以及酶聯(lián)免疫斑點檢測均證明轉(zhuǎn)基因牛具有拮抗結(jié)核菌的功能,尸檢發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因牛臟器的病理得分顯著低于普通牛。5.針對肌成束同源蛋白1(FSCN1)和肌動蛋白(ACTB)的基因間序列設(shè)計并構(gòu)建3對TALENs并獲得針對F-A位點打靶的單克隆細胞。通過序列相似性比對,在�；蚪M上分別找了8個靶向M-S位點和F-A位點TALE切口酶的潛在脫靶位點并進行脫靶效應分析。在22株F-A位點打靶細胞和19株F-A位點打靶細胞中發(fā)現(xiàn)一株細胞克隆存在脫靶效應。說明TALE切口酶雖然可以在�；蚪M上任意位點進行基因操作,但仍有可能會對細胞造成不可預知的損傷,因此在基因敲入前需要注意尋找可以容納外源基因的“安全港灣”。本研究首次利用TALE切口酶對�；蚪M進行基因敲入,并生產(chǎn)出具有抗結(jié)核病功能的轉(zhuǎn)基因牛。研究結(jié)果不僅對牛結(jié)核病的防御與控制有重大意義,同時為動物抗病育種提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：TALEN 基因打靶 同源重組 結(jié)核病 轉(zhuǎn)基因牛
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.23
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 文獻綜述15-43
• 第一章 轉(zhuǎn)基因動物研究進展15-31
• 1.1 轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展史15-16
• 1.2 轉(zhuǎn)基因動物的應用16-21
• 1.2.1 轉(zhuǎn)基因動物在理論研究上的應用16
• 1.2.2 轉(zhuǎn)基因動物在醫(yī)學上的應用16-18
• 1.2.3 轉(zhuǎn)基因動物在農(nóng)業(yè)上的應用18-21
• 1.3 基因打靶技術(shù)的研究進展21-31
• 1.3.1 轉(zhuǎn)座子21-25
• 1.3.2 鋅指核酸酶25-27
• 1.3.3 TALEN27-28
• 1.3.4 RGEN（CRISPR/Cas RNA-Guided Nuclease）系統(tǒng)28-31
• 第二章 TALEN在動物遺傳修飾中的應用31-43
• 2.1 TALEN的發(fā)明31-32
• 2.2 TALEN的設(shè)計與構(gòu)建32-35
• 2.2.1 TALEN的設(shè)計32-33
• 2.2.2 TALEN表達載體的構(gòu)建方法33-35
• 2.3 TALEN與ZFN和RGEN的特點比較35-39
• 2.3.1 切割成功率和切割效率36
• 2.3.2 DNA序列識別特異性36-37
• 2.3.3 細胞毒性37-39
• 2.4 TALEN介導的基因修飾的應用39-43
• 2.4.1 在細胞水平上的應用40-41
• 2.4.2 在模式動物上的應用41
• 2.4.3 在家畜上的應用41-43
• 試驗研究43-106
• 第三章 TALEN真核表達載體的構(gòu)建及活性分析43-57
• 3.1 材料和試劑43-44
• 3.1.1 材料43
• 3.1.2 試劑43-44
• 3.2 方法44-49
• 3.2.1 TALEN真核表達載體的構(gòu)建44-46
• 3.2.2 TALEN在 293-FT細胞中的切割活性分析46-47
• 3.2.3 TALEN在BFFs細胞中的切割活性分析47-49
• 3.2.4 TALE切.酶的構(gòu)建及活性檢測49
• 3.3 結(jié)果49-56
• 3.3.1 TALEN真核表達載體的構(gòu)建49-52
• 3.3.2 TALEN在 293-FT細胞中的切割活性分析52
• 3.3.3 TALEN在BFFs細胞中的切割活性分析52-54
• 3.3.4 TALE核酸切.酶活性檢測54-56
• 3.4 討論56
• 3.5 小結(jié)56-57
• 第四章 SP110定點打靶細胞篩選及轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)57-74
• 4.1 材料和試劑57-58
• 4.1.1 材料57
• 4.1.2 試劑57-58
• 4.2 方法58-63
• 4.2.1 MSR1啟動子活性驗證58-59
• 4.2.2 小鼠SP110基因功能驗證59-60
• 4.2.3 打靶載體構(gòu)建60-61
• 4.2.4 細胞篩選及驗證61-63
• 4.2.5 體細胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛63
• 4.3 結(jié)果63-73
• 4.3.1 MSR1啟動子活性驗證63-64
• 4.3.2 SP110基因功能驗證64-66
• 4.3.3 打靶載體構(gòu)建66-67
• 4.3.4 細胞篩選及驗證67-71
• 4.3.5 體細胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛71-73
• 4.4 討論73
• 4.5 小結(jié)73-74
• 第五章 轉(zhuǎn)基因�？菇Y(jié)核菌驗證74-96
• 5.1 材料和試劑74-75
• 5.1.1 材料74
• 5.1.2 試劑74-75
• 5.2 方法75-80
• 5.2.1 Junction PCR75
• 5.2.2 Genome walking75
• 5.2.3 Southern blot75
• 5.2.4 Western Blot75-76
• 5.2.5 Real Time RT-PCR76-77
• 5.2.6 細胞CFU計數(shù)77
• 5.2.7 流式細胞術(shù)分析凋亡率77
• 5.2.8 病理學評分系統(tǒng)77-78
• 5.2.9 器官CFU計數(shù)78
• 5.2.10 結(jié)核菌傳染實驗78
• 5.2.11 結(jié)核菌素皮膚試驗78-79
• 5.2.12 IFN-γ釋放水平檢測79
• 5.2.13 酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT）79
• 5.2.14 蘇木精-伊紅染色（HE染色）79
• 5.2.15 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析79-80
• 5.3 結(jié)果80-94
• 5.3.1 Junction PCR驗證陽性細胞80
• 5.3.2 Genome walking驗證陽性細胞80-81
• 5.3.3 Southern Blot篩選單等位基因打靶克隆81-82
• 5.3.4 Western Blot驗證SP110基因的表達82
• 5.3.5 外周血單核細胞誘導分化為巨噬細胞82-83
• 5.3.6 Real-Time RT PCR檢測臨近基因表達水平83-84
• 5.3.7 細胞水平上攻菌后CFU計數(shù)84-85
• 5.3.8 流式細胞術(shù)分析細胞死亡方式85
• 5.3.9 體內(nèi)攻菌后的病理評分85-87
• 5.3.10 體內(nèi)攻菌后的器官CFU計數(shù)87
• 5.3.11 傳染實驗中的結(jié)核菌素皮試檢測87-88
• 5.3.12 傳染實驗中的IFN-γ釋放水平88-89
• 5.3.13 酶聯(lián)免疫斑點檢測產(chǎn)生IFN-γ反應的細胞數(shù)89-90
• 5.3.14 傳染實驗后的病理學評分90-91
• 5.3.15 傳染實驗后的病理切片檢測91
• 5.3.16 SP110轉(zhuǎn)基因牛子代分析91-94
• 5.4 討論94-95
• 5.5 小結(jié)95-96
• 第六章 TALE核酸切.酶應用評估96-106
• 6.1 材料和試劑96-97
• 6.1.1 材料96
• 6.1.2 試劑96-97
• 6.2 方法97-98
• 6.2.1 針對F-A位點TALEN表達載體的構(gòu)建97
• 6.2.2 BFF細胞中檢測F-A位點TALENs的切割活性97
• 6.2.3 轉(zhuǎn)基因克隆胚構(gòu)建以及體細胞核移植97
• 6.2.4 Real-Time PCR檢測F-A位點臨近基因的表達水平97-98
• 6.2.5 TALEN的脫靶效應分析98
• 6.3 結(jié)果98-104
• 6.3.1 TALEN在F-A位點打靶98-101
• 6.3.2 TALEN的脫靶效應分析101-104
• 6.4 討論104-105
• 6.5 小結(jié)105-106
• 全文結(jié)論106-107
• 創(chuàng)新之處和進一步研究的課題107-108
• 參考文獻108-122
• 附錄122-137
• 致謝137-138
• 個人簡介138

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 肖安;胡瑩瑩;王唯曄;楊志們;王展翔;黃鵬;佟向軍;張博;林碩;;人工鋅指核酸酶介導的基因組定點修飾技術(shù)[J];遺傳;2011年07期

2 Chuanxian Wei;Jiyong Liu;Zhongsheng Yu;Bo Zhang;Guanjun Gao;Renjie Jiao;;TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J];遺傳學報(英文版);2013年06期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王勇勝;優(yōu)化核移植技術(shù)并生產(chǎn)轉(zhuǎn)人溶菌酶和β-防御素-3克隆牛的研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2009年

  本文關(guān)鍵詞：TALE切口酶介導SP110基因定點敲入生產(chǎn)抗結(jié)核病轉(zhuǎn)基因牛的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：359977