本文關(guān)鍵詞：日本囊對蝦中抗菌肽分子基因克隆及功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在無脊椎動物中,由于其缺少傳統(tǒng)意義上的適應(yīng)性免疫,先天免疫系統(tǒng)在宿主對抗病原體的反應(yīng)中發(fā)揮著非常重要的作用�？咕�(antimicrobial peptides, AMPs)在先天免疫防御中發(fā)揮著效應(yīng)分子的作用,可以直接殺死或清除病原微生物。在本論文中,我們以日本囊對蝦為材料,對抗菌肽家族(含WAP結(jié)構(gòu)域蛋白和抗脂多糖因子)中的成員進行了研究,得到以下結(jié)果：1.日本囊對蝦含單一單一乳清酸性蛋白(WAP)結(jié)構(gòu)域的抗菌肽的功能研究甲殼動物中含單一乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域(a single whey acidic protein domain, SWD)的抗菌肽屬于Ⅲ型甲殼肽,具有蛋白酶抑制活性或抑菌活性。然而它在甲殼動物體內(nèi)的功能尚未被闡述。在本論文中,我們在日本囊對蝦中擴增得到一種SWD抗菌肽,稱為MjSWD。MjSWD的全長為522bp,開放閱讀框編碼一條含24個氨基酸信號肽的蛋白。組織分布結(jié)果顯示,MjSWD在血細胞、心、肝胰腺、鰓、胃和腸組織中均有表達,qRT-PCR分析其表達模式表明,對蝦受到鰻弧菌、金黃色葡萄球菌和白斑病毒的刺激后MjSWD在鰓和胃中表達量上調(diào)。純化的重組蛋白MjSWD可以通過結(jié)合細菌表面的肽聚糖結(jié)合革蘭氏陽性菌和陰性菌,并且可以抑制絲氨酸蛋白酶活性,如枯草桿菌蛋白酶A、蛋白酶K,還可以抑制細菌分泌的蛋白酶活性。與重組蛋白孵育過的鰻弧菌在自然感染的情況下對日本對蝦的感染能力明顯低于對照組,說明MjSWD在對蝦抗細菌免疫中發(fā)揮著重要的作用。2.日本囊對蝦一種新型抗脂多糖因子的功能研究抗脂多糖因子(ALF)是甲殼動物中具有廣譜抗菌活性的效應(yīng)分子,在對蝦中已發(fā)現(xiàn)四類抗脂多糖因子(ALF-A—ALF-B)。我們在日本囊對蝦中得到一類新型抗脂多糖因子,命名為MjALF-E。E組中含有兩條新型抗脂多糖因子,MjALF-E1和MjALF-E2。組織分布分析表明MjALF-E1主要在血細胞、心臟和小腸中高表達,而MjALF-E2主要表達在鰓、胃和小腸中,并且二者在受到細菌刺激后轉(zhuǎn)錄水平上都有所提高。重組表達的重組蛋白rMjALF-E2對細菌表面的多糖LPS和PGN表現(xiàn)出較弱的結(jié)合活性,人工合成的兩種抗脂多糖因子的LPS結(jié)合的結(jié)構(gòu)域多肽對細菌表面的多糖LPS和PGN有較強的結(jié)合活性。而且合成的多肽和重組表達的rMjALF-E2對革蘭氏陰性菌有抑制活性。體內(nèi)實驗表明,MjALF-E2可以幫助體內(nèi)弧菌清除。通過RNA干擾的方式敲降MjALF-EZ的表達,然后感染鰻弧菌,相對于對照組對蝦的累計死亡率明顯升高。綜上所述,MjALF-E2在對蝦抵抗細菌侵染的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。3.日本囊對蝦中具有抗病毒的抗脂多糖因子(MjALF-D2)的功能研究抗脂多糖因子(ALF)的廣譜抗菌活性在很多甲殼動物中都有報道,近幾年還發(fā)現(xiàn)其具有抗病毒活性,但具體的抗病毒機理還不清楚。在本研究中,我們構(gòu)建了日本囊對蝦的9種抗脂多糖因子的重組表達載體,進行了重組表達與純化。將純化得到的重組蛋白與白斑綜合征病毒(WSSV)孵育注射到對蝦體內(nèi),分析對蝦體內(nèi)WSSV的復(fù)制,結(jié)果得到一種具有抗毒活性的抗脂多糖因子MjALF-D2。RT-PCR分析其在日本囊對蝦各組織中的表達情況,MjALF-D2在除肝胰腺外的各組織中均有所分布,在鰓和胃組織中表達量最高。白斑病毒刺激后不同時間段的表達模式分析結(jié)果表明,在受到病原刺激后MjALF-D2表達量明顯上調(diào)。體內(nèi)實驗結(jié)果表明：注射重組蛋白和白斑病毒的實驗組對蝦體內(nèi)病毒的含量明顯低于對照組對蝦；相反的,通過注射雙鏈RNA將MjALF-D2干擾掉后,對蝦體內(nèi)的病毒復(fù)制率升高。因此,體內(nèi)感染白斑病毒的實驗證明了MjALF-D2的抗毒活性。重組蛋白MjALF-D2還可以通過結(jié)合細菌表而的多糖與革蘭氏陽性菌和陰性菌結(jié)合,并對少數(shù)細菌具有微弱的抑制活性。以上實驗結(jié)果表明,MjALF-D2同時參與對蝦抗病毒免疫反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：日本囊對蝦 先天免疫 抗菌肽 含單WAP結(jié)構(gòu)域蛋白 蛋白酶抑制活性 抗脂多糖因子 白斑病毒
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;S945.4
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 符號說明12-14
• 第一部分 綜述無脊椎動物先天免疫14-26
• 一、免疫系統(tǒng)概述14-15
• 1、先天免疫14
• 2、適應(yīng)性免疫14-15
• 二、無脊椎動物先天免疫15-16
• 1、細胞免疫15
• 2、體液免疫15-16
• 三、甲殼動物中抗菌肽研究概述16-23
• 1、對蝦素(Penaeidin)17
• 2、溶菌酶(Lysozymes)17
• 3、含WAP結(jié)構(gòu)域蛋白(crustin)17-19
• 4、抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccaride factors)19-23
• 四、本研究目的和意義23-26
• 第二部分 日本囊對蝦中抗菌肽性質(zhì)與功能研究26-80
• 第一章 含單乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域的甲殼肽具有抑制細菌對日本囊對蝦侵染的功能26-50
• 一、前言26-27
• 二、材料方法27-38
• 1. 材料27-28
• 1.1. 實驗材料27
• 1.2. 菌株和載體27-28
• 1.3. 儀器和試劑28
• 2、方法28-38
• 2.1. 日本囊對蝦免疫刺激及血細胞的分離28
• 2.2. mRNA提取28-29
• 2.3. cDNA第一鏈合成29
• 2.4. 序列分析29-30
• 2.5. 半定量RT-PCR30
• 2.6. 熒光定量RT-PCR30
• 2.7. 重組表達30-34
• 2.8. 絲氨酸蛋白酶抑制活性34-35
• 2.9. rMjSWD的抑制動力學(xué)35
• 2.10. rMjSWD的理化性質(zhì)35-36
• 2.11 細菌結(jié)合實驗36-37
• 2.12. Western blot37
• 2.13. rMjSWD抑制細菌分泌蛋白酶活性37
• 2.14. 弧菌自然感染對蝦37-38
• 三、結(jié)果38-47
• 1. 序列分析38-39
• 2. 系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建39-41
• 3. MjSWD在各組織中的分布及受病原刺激后表達變化41-42
• 4. 重組蛋白表達與純化42
• 5. rMjSWD抑制蛋白酶活性和抑制動力學(xué)42-44
• 6. rMjSWD的理化性質(zhì)44
• 7. rMjSWD通過結(jié)合細菌表面的多糖具有結(jié)合細菌活性44-45
• 8. rMjSWD抑制細菌分泌的蛋白酶活性45-46
• 9. rMjSWD保護蝦體不受細菌感染46-47
• 四、討論47-50
• 第二章 日本囊對蝦中抗脂多糖因子具有抗菌活性50-68
• 一、前言50-51
• 二、材料方法51-56
• 1. 菌株和載體51
• 2. 儀器和試劑51-52
• 3. 實驗材料52
• 4. 方法52-56
• 4.1. 日本囊對蝦免疫刺激及血細胞的分離52
• 4.2. mRNA提取52
• 4.3. cDNA第一鏈合成52
• 4.4. 序列分析52
• 4.5. 半定量RT-PCR52-53
• 4.6. 熒光定量RTPCR53
• 4.7. 重組表達53
• 4.8. 重組蛋白大規(guī)模表達純化53-54
• 4.9. 液體抑菌實驗54
• 4.10. 多糖結(jié)合實驗54-55
• 4.11. 體內(nèi)清除實驗55-56
• 三、實驗結(jié)果56-64
• 1. 序列分析及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建56-59
• 2. ALFs的組織分布59-60
• 3. 細菌刺激后MjALF-Es高表達60
• 4. rMjALF-Es可以抑制革蘭氏陰性菌的生長60-61
• 5. 多糖結(jié)合活性61-62
• 6. 體內(nèi)弧菌清除62-64
• 7. 致死率統(tǒng)計64
• 四、討論64-68
• 第三章 日本囊對蝦的D-類抗脂多糖因子具有抗病毒的功能68-80
• 一、前言68-69
• 二、材料和方法69-72
• 1. 菌株,病毒、載體和實驗試劑69
• 2. 實驗材料和免疫刺激69
• 3. 血細胞分離與組織RNA提取69
• 4. 半定量RT-PCR和實時定量qRT-PCR69-70
• 5. 重組蛋白表達純化70-71
• 6. 重組蛋白抗病毒活性檢測71
• 7. 在MALF-D2沉默的對蝦中WSSV的復(fù)制率檢測71
• 8. 血細胞體外培養(yǎng)及WSSV病毒感染71
• 9. Westem b1ot71-72
• 三、結(jié)果72-77
• 1、重組表達六種ALF,檢測體內(nèi)抗病毒活性72-73
• 2、MjALF-D2的組織分布和表達模式73-74
• 3、重組蛋白rMjALF-D2抑制WSSV在體內(nèi)的復(fù)制74-75
• 4、WSSV在MjALF-D2沉默的對蝦體內(nèi)復(fù)制量升高75-77
• 5、重組蛋白rMjALF-D2可以保護血細胞免受WSSV侵染77
• 四、討論77-80
• 論文的創(chuàng)新點及意義80-82
• 參考文獻82-89
• 致謝89-90
• 在讀期間發(fā)表文章90-91
• 附件91

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 卜興江;杜欣軍;周文杰;趙小凡;王金星;;中國明對蝦溶菌酶基因克隆、重組表達與性質(zhì)分析[J];生物工程學(xué)報;2008年05期

  本文關(guān)鍵詞：日本囊對蝦中抗菌肽分子基因克隆及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：358120