本文關鍵詞：厚垣孢普克尼亞菌產(chǎn)生的金輪霉素對秀麗隱桿線蟲作用靶點的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：由于線蟲抗藥性的出現(xiàn)和綠色抗寄生線蟲藥物的匱乏,植物寄生線蟲已成為危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個全球性問題。從微生物次生代謝產(chǎn)物中尋找新型高效廣譜性抗線蟲天然化合物并確定其作用機制是研發(fā)綠色抗線蟲藥物的重要手段。本研究以食線蟲真菌厚垣孢普克尼亞菌(Pochonia chlamydosporia)中篩選得到的一類產(chǎn)率高、活性強的金輪霉素為研究對象,以秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)為模型探討了該類化合物主要成分金輪霉素D對線蟲的毒性機制,鑒定了線蟲抗金輪霉素D的抗性突變位點。主要研究結果如下：1.對17株厚垣孢普克尼亞菌馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的發(fā)酵液進行殺線蟲活性篩選,獲得到三株對秀麗隱桿線蟲毒性極強的菌株YMF1.00615, YMF1.00613和YMF1.00111。這三株真菌的PDB發(fā)酵液中均顯示為亮黃色,化學分析檢測到發(fā)酵液中均含有大量金輪霉素類化合物,定量分析發(fā)現(xiàn)金輪霉素D為抗線蟲活性發(fā)酵液中的主要成分,產(chǎn)量超過300μg/mL。金輪霉素D在半致死濃度下可以抑制秀麗隱桿線蟲進食速率和線蟲幼蟲發(fā)育,大大縮短線蟲壽命,并減少線蟲后代數(shù)目�；钚詼y試發(fā)現(xiàn)金輪霉素D對南方根結線蟲幼蟲的毒性是對秀麗隱桿線蟲毒性的兩倍。2.通過微陣列芯片分析發(fā)現(xiàn)金輪霉素D可誘導秀麗隱桿線蟲基因組中與脫毒,壓力應激和免疫反應相關的大量基因表達水平發(fā)生上調(diào)。3.發(fā)現(xiàn)胰島素生長因子信號通路中的叉頭(DAF-16/FOX0)轉(zhuǎn)錄因子參與了線蟲應對金輪霉素D毒性的過程。突變體daf-16(mu86)對金輪霉素D具有超敏感性,而負調(diào)控DAF-16的突變體daf-2(e1370)對金輪霉素D具有抗性。4.篩選得到了秀麗隱桿線蟲抗金輪霉素D突變體。采用甲基磺酸乙酯隨機誘變約60000個野生型N2品系基因組,通過F2遺傳學篩選得到了4個對金輪霉素D具有抗性的突變品系M1, M2, M3, M4。確定M1對金輪霉素D的抗性表型是由單個基因的顯性突變導致的。5.定位了M1中對金輪霉素D抗性突變位點。以M1突變體和CB4856品系為親本,構建了F2群,經(jīng)單核苷酸酸多態(tài)性(SNP)定位,將抗性突變位點限定到三號染色體-2.97厘摩至-1.57厘摩之間。同時對M1進行基因組測序,通過比對M1和用于誘變的N2品系線蟲在2.97厘摩至-1.57厘摩區(qū)域之間的變異,最終確定ATP合成酶β亞基第471位精氨酸突變成了組氨酸。6.秀麗隱桿線蟲ATP合成酶p亞基第471位精氨酸的位置在寄生線蟲中通常也是精氨酸。在15種序列已知的寄生線蟲中,11種寄生線蟲在秀麗隱桿線蟲ATP合成酶p亞基第471位精氨酸的位置是精氨酸。本研究從食線蟲真菌厚垣孢普克尼亞菌中篩選得到具有殺線蟲活性的金輪霉素D。通過對野生型秀麗隱桿線蟲進行遺傳學篩選,得到對金輪霉素D具有抗性的突變體。對抗性突變體進行SNP定位和基因組測序分析,發(fā)現(xiàn)ATP合成酶p亞基第471位精氨酸錯義突變?yōu)榱私M氨酸,此突變保護突變體免受金輪霉素D的毒性影響。而且在ATP合成酶p亞基序列已知的15種寄生線蟲中,11種寄生線蟲中的這個位置都是精氨酸。所以本研究為尋找開發(fā)真菌來源的靶點新穎的廣譜性殺線蟲制劑提供了重要的參考價值。
【關鍵詞】：厚垣孢普克尼亞菌 金輪霉素 秀麗隱桿線蟲 ATP-2 根結線蟲
【學位授予單位】：云南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S476.1
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 緒論10-38
• 1 生防真菌厚垣孢普克尼亞菌研究進展10-11
• 1.1 厚垣孢普克尼亞菌的生防機制10-11
• 1.2 厚垣孢普克尼亞菌次生代謝產(chǎn)物研究進展11
• 2 天然產(chǎn)物金輪霉素及其功能11-17
• 2.1 生物學來源及一般特性11-12
• 2.2 作為熒光探針12
• 2.3 抑制F_1F_o-ATP合成酶12-15
• 2.4 毒性15-16
• 2.5 作用機制研究現(xiàn)狀16-17
• 3 秀麗隱桿線蟲在小分子抗寄生蟲藥物作用靶點研究的作用17-38
• 3.1 研究優(yōu)勢17
• 3.2 研究策略17-19
• 3.3 在抗動物寄生蟲小分子藥物靶點研究中的作用19-34
• 3.4 在抗植物寄生蟲小分子藥物靶點研究中的作用34-38
• 第二章 厚垣孢普克尼亞菌中殺線蟲化合物的篩選38-56
• 1 材料與方法38-45
• 1.1 主要試劑和儀器38-39
• 1.2 培養(yǎng)基和常用試劑的配制39-40
• 1.3 供試材料40
• 1.4 厚垣孢普克尼亞菌PDB發(fā)酵液對秀麗隱桿線蟲和南方根結線蟲毒性測試40-42
• 1.5 PDB發(fā)酵液中金輪霉素的化學檢測42-43
• 1.6 厚普克尼亞菌發(fā)酵液對番茄生長情況的影響43-44
• 1.7 真菌PDB發(fā)酵液對植物病原真菌的拮抗作用44-45
• 2 結果與討論45-55
• 2.1 利用ITS序列進行的菌種鑒定45-47
• 2.2 真菌PDB發(fā)酵液對秀麗隱桿線蟲幼蟲毒性測試結果47
• 2.3 PDB發(fā)酵液中金輪霉素含量47-49
• 2.4 金輪霉素D對秀麗隱桿線蟲和南方根結線蟲幼蟲毒性測試結果49-50
• 2.5 厚垣孢普克尼亞菌對番茄生長情況的影響50-52
• 2.6 厚垣孢普克尼亞菌PDB發(fā)酵液對植物病原真菌的抑制作用52-55
• 3 小結55-56
• 第三章 金輪霉素D對秀麗隱桿線蟲毒性研究56-74
• 1 材料與方法56-60
• 1.1 供試材料和試劑56
• 1.2 培養(yǎng)基和常用試劑的配制56
• 1.3 金輪霉素D對秀麗隱桿線蟲毒性56-58
• 1.4 微陣列芯片分析金輪霉素D對秀麗隱桿線蟲基因表達水平影響58-60
• 1.5 數(shù)據(jù)分析60
• 2 結果與討論60-72
• 2.1 金輪霉素D對秀麗隱桿線蟲毒性61-63
• 2.2 金輪霉素D對秀麗隱桿線蟲基因表達水平的影響63-67
• 2.3 daf-16途徑對金輪霉素D毒性的影響67-70
• 2.4 與天然免疫相關的反應70-72
• 3 小結72-74
• 第四章 秀麗隱桿線蟲抗金輪霉素D突變的篩選及定位74-113
• 1 材料與方法75-90
• 1.1 主要試劑和儀器75-76
• 1.2 培養(yǎng)基和常用試劑的配制76
• 1.3 供試線蟲76
• 1.4 篩選F_1F_o-ATP合成酶突變體對金輪霉素D抗性76-77
• 1.5 篩選金輪霉素D抗性突變體77-80
• 1.6 利用MT465株系對突變位點進行染色體定位80-81
• 1.7 利用CB4856株系對突變位點進行單核苷酸多態(tài)性定位81-89
• 1.8 金輪霉素D抗性突變體基因組重測序89-90
• 1.9 構建蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹90
• 2 結果與討論90-111
• 2.1 F_1F_o-ATP合成酶突變體對金輪霉素D抗性91-93
• 2.2 甲基磺酸乙酯誘變和F2篩選獲得金輪霉素D抗性突變體93-94
• 2.3 突變體與野生型親本的回交實驗94-95
• 2.4 判斷突變體抗性是否為顯性95-96
• 2.5 利用定位線蟲品系對突變位點進行染色體初步定位96
• 2.6 利用單核苷酸多態(tài)性對突變位點進行染色體和區(qū)間定位96-98
• 2.7 突變體的全基因組測序98-111
• 3 小結111-113
• 創(chuàng)新與展望113-114
• 參考文獻114-137
• 附錄137-169
• 研究成果169-170
• 致謝170-171

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本文編號：356518