朊病毒種屬屏障的分子機理研究與重組朊病毒食源性傳播致病模型的建立
發(fā)布時間：2021-12-23 07:13
朊病毒疾病又稱傳染性海綿狀腦病,是一種人畜共患的致死性神經(jīng)退行性疾病,具有傳染性、散發(fā)性或遺傳性等特點。與傳統(tǒng)病毒不同的是,朊病毒疾病的病原體是由宿主體內(nèi)正常表達的朊蛋白（Pr PC）經(jīng)過錯誤折疊后形成的;這種異常變構(gòu)的朊蛋白(Pr PSc)一旦進入新的宿主,就可以把宿主Pr PC作為底物,誘導(dǎo)其構(gòu)象轉(zhuǎn)變成Pr PSc,從而導(dǎo)致Pr PSc的擴增,形成自我增殖和疾病的傳染。通常將這類具有傳染性的Pr PSc稱為朊病毒。朊病毒與傳統(tǒng)意義上的病毒概念不同,它的遺傳物質(zhì)主要是錯構(gòu)的蛋白質(zhì),在體外運用蛋白質(zhì)錯誤構(gòu)象循環(huán)擴增技術(shù)（s PMCA）就能將朊病毒擴增。在這一過程中,少量的Pr PSc作為種子加入至正常動物的腦勻漿或重組的朊蛋白（Pr P）中共同孵育,Pr PSc種子就可誘導(dǎo)Pr PC轉(zhuǎn)變?yōu)镻r PSc,新生成的Pr PSc形成聚合物,在超聲的作用下...
【文章來源】：華東師范大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：138 頁
【學(xué)位級別】：博士
【部分圖文】：
PrP一級結(jié)構(gòu)與立體構(gòu)象示意圖(A)PrP一級結(jié)構(gòu)示意圖
華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文3變?yōu)镻rPSc，而新生成的PrPSc聚合物在超聲的作用下能夠形成更小的寡聚體核心，為后續(xù)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程提供新的seed，如此超聲—孵育的循環(huán)過程就能夠在較短周期內(nèi)將PrPSc在樣本中進行擴增[8]。不僅如此，Soto等人還證明了通過sPMCA擴增得到的PrPSc能夠保留與seed一致的特性，如動物感染后的潛伏期、不同腦區(qū)海綿狀損傷得分、PK酶抗性、Westernblotting檢測特征條帶等[9]。圖2.sPMCA工作原理和模型圖在sPMCA過程中，將少量的含有PrPSc的腦勻漿作為種子加入至未被感染的腦勻漿中共同孵育，誘導(dǎo)其中的PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc，新生成的PrPSc聚合物在超聲的作用下形成更小的寡聚體核心，為后續(xù)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程提供新的seed。Fig.2TheprocessofsPMCAIntheprocessofsPMCA,asmallamountofbrainhomogenatecontainingPrPScisaddedasseedintotheuninfectedbrainhomogenateforco-incubation,whichcaninducePrPCconversionintoPrPSc.ThenewlyformedPrPScaggregatesformasmalleroligomercorebysonication,providingnewseedsforthesubsequentconformationtransitionprocess.由于具有傳染性，朊病毒疾病可以在許多種屬中發(fā)生。通常情況下，朊病毒在本種屬中能夠有效傳播，被感染的動物能夠在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)發(fā)病并短時間內(nèi)全部死亡；但跨種屬傳播的效率則變得非常低，動物生存時間存在很大的個體差異，或者完全不能跨種屬傳播。這其中小鼠和倉鼠朊病毒的種屬屏障現(xiàn)象是最為典型的例子之一。因此，sPMCA在研究朊病毒種屬屏障中的優(yōu)勢就得到了充分體現(xiàn)，一方面能夠忠實保留某一物種朊病毒的特性，另一方面又能夠大幅縮短研究時間。Soto團隊利用sPMCA，以小鼠和倉鼠腦勻漿為實驗材料，實現(xiàn)了小鼠/倉鼠朊病毒的跨種屬傳播，并且分離得到了全新的
華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文4正是由于sPMCA技術(shù)能夠在體外將朊病毒變構(gòu)過程量化進行，為了徹底證明朊病毒的遺傳信息儲存于自身構(gòu)象中，利用大腸桿菌表達重組PrP并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兄虏⌒缘臉?gòu)象成了關(guān)鍵一步。我們實驗室于2010年突破性地在sPMCA體系中引入了脂類分子和RNA作為輔助因子（cofactor），成功地將細菌表達的重組小鼠PrP轉(zhuǎn)變成為具有PK酶抗性的構(gòu)象（PrP-res），同時還具有高度傳染性，能夠使野生型小鼠在短期內(nèi)獲得朊病毒疾病[11]。這是世界上第一個在體外從無至有（denovo）合成的重組小鼠朊病毒，通過顱內(nèi)注射的方式，野生型小鼠的平均生存時間約為180天[11,12]；通過腹腔注射的方式，同樣使小鼠獲得了朊病毒疾病，其生存時間約為210天[13]。圖3.以重組小鼠PrPC為底物從無至有地制備重組小鼠PrPSc在sPMCA體系中引入了脂類分子和RNA作為輔助因子，將重組小鼠PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兄虏⌒缘闹亟M小鼠PrPSc。Fig.3DenovogenerationofPrPScusingrecombinantmousePrPCassubstrateInthepresenceoflipidandRNAascofactors,wegeneratedaprionusingrecombinantmouseprionprotein.可以看到sPMCA技術(shù)是現(xiàn)代研究朊病毒疾病中的一種重要手段。在本文中，我們將探究一些朊病毒研究領(lǐng)域尚未解決的問題：一方面，以重組PrP為對象，利用sPMCA重點探究不相同的氨基酸位點對小鼠/倉鼠朊病毒種屬屏障的影響，并嘗試獲得能夠跨種屬屏障的過渡型朊病毒，進而制備重組倉鼠朊病毒；另一方面，我們將
本文編號：3548037
【文章來源】：華東師范大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：138 頁
【學(xué)位級別】：博士
【部分圖文】：
PrP一級結(jié)構(gòu)與立體構(gòu)象示意圖(A)PrP一級結(jié)構(gòu)示意圖
華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文3變?yōu)镻rPSc，而新生成的PrPSc聚合物在超聲的作用下能夠形成更小的寡聚體核心，為后續(xù)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程提供新的seed，如此超聲—孵育的循環(huán)過程就能夠在較短周期內(nèi)將PrPSc在樣本中進行擴增[8]。不僅如此，Soto等人還證明了通過sPMCA擴增得到的PrPSc能夠保留與seed一致的特性，如動物感染后的潛伏期、不同腦區(qū)海綿狀損傷得分、PK酶抗性、Westernblotting檢測特征條帶等[9]。圖2.sPMCA工作原理和模型圖在sPMCA過程中，將少量的含有PrPSc的腦勻漿作為種子加入至未被感染的腦勻漿中共同孵育，誘導(dǎo)其中的PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc，新生成的PrPSc聚合物在超聲的作用下形成更小的寡聚體核心，為后續(xù)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程提供新的seed。Fig.2TheprocessofsPMCAIntheprocessofsPMCA,asmallamountofbrainhomogenatecontainingPrPScisaddedasseedintotheuninfectedbrainhomogenateforco-incubation,whichcaninducePrPCconversionintoPrPSc.ThenewlyformedPrPScaggregatesformasmalleroligomercorebysonication,providingnewseedsforthesubsequentconformationtransitionprocess.由于具有傳染性，朊病毒疾病可以在許多種屬中發(fā)生。通常情況下，朊病毒在本種屬中能夠有效傳播，被感染的動物能夠在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)發(fā)病并短時間內(nèi)全部死亡；但跨種屬傳播的效率則變得非常低，動物生存時間存在很大的個體差異，或者完全不能跨種屬傳播。這其中小鼠和倉鼠朊病毒的種屬屏障現(xiàn)象是最為典型的例子之一。因此，sPMCA在研究朊病毒種屬屏障中的優(yōu)勢就得到了充分體現(xiàn)，一方面能夠忠實保留某一物種朊病毒的特性，另一方面又能夠大幅縮短研究時間。Soto團隊利用sPMCA，以小鼠和倉鼠腦勻漿為實驗材料，實現(xiàn)了小鼠/倉鼠朊病毒的跨種屬傳播，并且分離得到了全新的
華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文4正是由于sPMCA技術(shù)能夠在體外將朊病毒變構(gòu)過程量化進行，為了徹底證明朊病毒的遺傳信息儲存于自身構(gòu)象中，利用大腸桿菌表達重組PrP并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兄虏⌒缘臉?gòu)象成了關(guān)鍵一步。我們實驗室于2010年突破性地在sPMCA體系中引入了脂類分子和RNA作為輔助因子（cofactor），成功地將細菌表達的重組小鼠PrP轉(zhuǎn)變成為具有PK酶抗性的構(gòu)象（PrP-res），同時還具有高度傳染性，能夠使野生型小鼠在短期內(nèi)獲得朊病毒疾病[11]。這是世界上第一個在體外從無至有（denovo）合成的重組小鼠朊病毒，通過顱內(nèi)注射的方式，野生型小鼠的平均生存時間約為180天[11,12]；通過腹腔注射的方式，同樣使小鼠獲得了朊病毒疾病，其生存時間約為210天[13]。圖3.以重組小鼠PrPC為底物從無至有地制備重組小鼠PrPSc在sPMCA體系中引入了脂類分子和RNA作為輔助因子，將重組小鼠PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兄虏⌒缘闹亟M小鼠PrPSc。Fig.3DenovogenerationofPrPScusingrecombinantmousePrPCassubstrateInthepresenceoflipidandRNAascofactors,wegeneratedaprionusingrecombinantmouseprionprotein.可以看到sPMCA技術(shù)是現(xiàn)代研究朊病毒疾病中的一種重要手段。在本文中，我們將探究一些朊病毒研究領(lǐng)域尚未解決的問題：一方面，以重組PrP為對象，利用sPMCA重點探究不相同的氨基酸位點對小鼠/倉鼠朊病毒種屬屏障的影響，并嘗試獲得能夠跨種屬屏障的過渡型朊病毒，進而制備重組倉鼠朊病毒；另一方面，我們將
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