Cry毒素（蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白）是目前應(yīng)用最為廣泛的微生物殺蟲劑,其作用機(jī)制包括“原毒素的活化、受體互作、寡聚化和膜穿孔”這三個(gè)步驟。目前Cry毒素的研究主要集中在Cry毒素與受體互作上,而關(guān)于毒素“活化、寡聚化和膜穿孔”等方面的研究則較少報(bào)道。本研究以對(duì)小菜蛾具有高毒力的Cry2Ab殺蟲蛋白為研究對(duì)象,分析Cry2Ab的活化機(jī)制,進(jìn)一步研究Cry2Ab的寡聚化機(jī)制并鑒定寡聚化相關(guān)的氨基酸殘基。主要結(jié)果如下所示:利用N端測(cè)序證明了小菜蛾中腸液的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶參與了Cry2Ab原毒素的活化（分別在Arg139和Leu144對(duì)Cry2Ab原毒素進(jìn)行了切割）;進(jìn)一步構(gòu)建了酶切位點(diǎn)突變的Cry2Ab突變體（R139A,L144A,R139A-L144A）,野生型和酶切位點(diǎn)單突變的Cry2Ab（R139A,L144A）都能被小菜蛾中腸液活化,這三種毒素對(duì)小菜蛾也具有較高的殺蟲活性;酶切位點(diǎn)雙突變的Cry2Ab突變體（R139A-L144A）不能被小菜蛾中腸液活化,同時(shí)對(duì)小菜蛾的殺蟲活性大幅度下降。這些結(jié)果表明活化是Cry2Ab發(fā)揮殺蟲活性的前提,Cry2Ab同時(shí)含有兩個(gè)酶切... 

【文章來(lái)源】：廈門大學(xué)福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：133 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 成孔毒素概述
    1.2 Cry毒素研究進(jìn)展
        1.2.1 Bt毒素概述
        1.2.2 Cry毒素結(jié)構(gòu)與功能研究
        1.2.3 Cry毒素作用機(jī)制
        1.2.4 Cry毒素活化研究
        1.2.5 Cry毒素與受體互作研究
            1.2.5.1 ABCC
            1.2.5.2 APN
            1.2.5.3 Cadherin
            1.2.5.4 ALP
            1.2.5.5 其他受體
        1.2.6 Cry毒素的寡聚化和膜穿孔研究
            1.2.6.1 Cry毒素的寡聚化機(jī)制研究
            1.2.6.2 Cry毒素的膜穿孔機(jī)制研究
        1.2.7 Cry毒素的定向改造
    1.3 本論文的研究目的與意義
2 材料與儀器
3 實(shí)驗(yàn)方法
    3.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建
        3.1.1 突變體引物設(shè)計(jì)
        3.1.2 重疊延伸PCR
        3.1.3 質(zhì)粒提取與PCR產(chǎn)物回收
        3.1.4 目的片段與載體的酶切與連接
        3.1.5 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21
        3.1.6 陽(yáng)性克隆鑒定
        3.1.7 DNA瓊脂糖凝膠電泳
    3.2 蛋白表達(dá)純化
        3.2.1 Cry2Ab蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.2 Cry2Ab蛋白純化
    3.3 小菜蛾相關(guān)實(shí)驗(yàn)
        3.3.1 小菜蛾飼養(yǎng)
        3.3.2 小菜蛾中腸液制備
        3.3.3 小菜蛾中腸液活化相關(guān)實(shí)驗(yàn)
        3.3.4 小菜蛾中腸BBMV制備
        3.3.5 小菜蛾生測(cè)實(shí)驗(yàn)
    3.4 免疫印跡和配體印跡
        3.4.1 免疫印跡
        3.4.2 配體印跡
    3.5 N端測(cè)序
    3.6 寡聚化實(shí)驗(yàn)
    3.7 分子篩
    3.8 透射電鏡實(shí)驗(yàn)
    3.9 生物膜干涉實(shí)驗(yàn)
    3.10 脂質(zhì)體泄露實(shí)驗(yàn)
    3.11 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分子對(duì)接
4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.1 Cry2Ab活化機(jī)制研究
        4.1.1 小菜蛾中腸液活化Cry2Ab原毒素
        4.1.2 N端測(cè)序鑒定Cry2Ab活化位點(diǎn)
        4.1.3 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活化Cry2Ab原毒素
        4.1.4 構(gòu)建酶切位點(diǎn)突變的Cry2Ab突變體
        4.1.5 酶切位點(diǎn)突變的Cry2Ab突變體原核表達(dá)
        4.1.6 胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶切位點(diǎn)雙突變導(dǎo)致Cry2Ab不能被活化
        4.1.7 胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶切位點(diǎn)雙突變導(dǎo)致Cry2Ab殺蟲活性下降
        4.1.8 Cry2Ab的活化機(jī)制:一種雙保險(xiǎn)模型
    4.2 α4-α5螺旋參與Cry2Ab的寡聚化研究
        4.2.1 活化導(dǎo)致Cry2Ab Domain I α4-α5螺旋的暴露
        4.2.2 構(gòu)建α4-α5螺旋被隱藏和被缺失的Cry2Ab突變體
            4.2.2.1 Cry2Ab突變體R139A-L144A和H5結(jié)構(gòu)分析
            4.2.2.2 Cry2Ab突變體H5原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化
        4.2.3 Cry2Ab突變體R139A-L144A和H5的活化分析
        4.2.4 α4-α5螺旋的隱藏或缺失導(dǎo)致Cry2Ab對(duì)小菜蛾的殺蟲活性下降
        4.2.5 α4-α5螺旋的隱藏或缺失導(dǎo)致Cry2Ab對(duì)小菜蛾中腸的損傷減弱
        4.2.6 α4-α5螺旋的隱藏或缺失不影響Cry2Ab與小菜蛾氨肽酶D3的結(jié)合
        4.2.7 α4-α5螺旋的隱藏或缺失不影響Cry2Ab與小菜蛾BBMV的結(jié)合
        4.2.8 α4-α5螺旋的暴露促進(jìn)Cry2Ab寡聚體的形成
    4.3 鑒定α4-α5螺旋參與Cry2Ab寡聚化關(guān)鍵殘基
        4.3.1 Cry2Ab α4-α5螺旋雙丙氨酸突變體原核表達(dá)載體構(gòu)建
        4.3.2 Cry2Ab α4-α5螺旋雙丙氨酸突變體表達(dá)純化及活化研究
        4.3.3 Cry2Ab α4-α5螺旋雙丙氨酸突變體寡聚化研究
        4.3.4 Cry2Ab α4-α5螺旋雙丙氨酸突變體的殺蟲毒力分析
        4.3.5 Cry2Ab α4-α5螺旋單丙氨酸突變體原核表達(dá)載體構(gòu)建
        4.3.6 Cry2Ab α4-α5螺旋單丙氨酸突變體的表達(dá)純化及活化研究
        4.3.7 鑒定Cry2Ab α4-α5螺旋參與寡聚化的關(guān)鍵殘基
        4.3.8 Cry2Ab α4-α5螺旋的單丙氨酸突變體的殺蟲毒力分析及膜穿孔能力分析
    4.4 Cry2Ab的寡聚化和膜穿孔機(jī)制
5 討論
    5.1 活化是Cry毒素發(fā)揮殺蟲活性的前提
    5.2 Cry2Ab的活化是種雙保險(xiǎn)
    5.3 α4-α5螺旋的暴露是Cry2Ab發(fā)揮殺蟲活性的前提
    5.4 α4-α5螺旋寡聚化和膜穿孔氨基酸殘基鑒定
結(jié)論
展望
參考文獻(xiàn)
博士期間發(fā)表論文
博士期間獲獎(jiǎng)情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]小菜蛾中腸氨肽酶基因PxAPN5的克隆、原核表達(dá)及蛋白質(zhì)同源建模分析[J]. 許煉,高煥娟,潘志針,朱育菁,陳清西,劉波.  昆蟲學(xué)報(bào). 2014(11)

博士論文
[1]抗Bt小菜蛾的選育、受體基因克隆及PTD對(duì)Cry1Ac的增效作用[D]. 楊峰山.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004



本文編號(hào)：3524778