棉纖維是紡織工業(yè)的重要原料。陸地棉因其產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣而成為世界上最主要的棉花栽培種。棉纖維發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,依次經(jīng)歷了起始期、伸長(zhǎng)期、次生壁合成增厚期和脫水成熟期四個(gè)時(shí)期。其中,伸長(zhǎng)期的時(shí)間長(zhǎng)短和伸長(zhǎng)速率共同決定棉纖維的最終長(zhǎng)度,進(jìn)而決定了纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀。近年來(lái),作為一類新的負(fù)調(diào)控因子,miRNA的相關(guān)研究迅猛發(fā)展,尤其是在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答等方面。本研究以陸地棉中棉所60伸長(zhǎng)期的棉纖維為材料,通過(guò)小RNA測(cè)序和降解組測(cè)序,旨在從全基因組水平上鑒定和篩選出與棉纖維伸長(zhǎng)相關(guān)的miRNA及其靶基因,進(jìn)而揭示它們?cè)诿蘩w維伸長(zhǎng)過(guò)程中的作用。通過(guò)小RNA測(cè)序,從陸地棉纖維伸長(zhǎng)的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)（開(kāi)花后5天、10天、15天和20天）中共獲得7417萬(wàn)條可分析的小RNA測(cè)序讀數(shù)。根據(jù)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的棉屬miRNA信息,比對(duì)出217個(gè)已知miRNA家族的375個(gè)miRNA。利用四倍體陸地棉基因組的全基因組序列鑒定到1957個(gè)潛在的新miRNA。差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)21個(gè)已知的miRNA和7個(gè)新的miRNA在棉纖維伸長(zhǎng)過(guò)程中顯著性差異表達(dá)。通過(guò)降解組測(cè)序,從陸地棉纖維伸長(zhǎng)的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)（... 

【文章來(lái)源】：清華大學(xué)北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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棉纖維細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程(Leeetal.,2007)

以對(duì)樣本中所有小RNA和相應(yīng)的靶基因序列進(jìn)行測(cè)序及表達(dá)定量，分別稱作小RNA測(cè)序（smallRNAsequencing）和降解組測(cè)序（degradomesequencing）。小RNA測(cè)序技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)有：（1）可以直接在核苷酸水平上對(duì)小RNA進(jìn)行研究，有利于區(qū)分同一小RNA家族中的不同小RNA分子或彼此非常相似的小RNA序列；（2）可以在沒(méi)有參考基因組序列信息和二級(jí)結(jié)構(gòu)信息的前提下，對(duì)任意物種進(jìn)行測(cè)序分析；（3）憑借其高靈敏度和較大的測(cè)序通量，可以為小RNA分子的發(fā)現(xiàn)和研究提供較高的數(shù)據(jù)深度及覆蓋率，并且可以檢測(cè)到表達(dá)豐度極低的稀有轉(zhuǎn)錄。圖1.2miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)miRNA數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)橫坐標(biāo)表示數(shù)據(jù)庫(kù)版本和更新日期，縱坐標(biāo)表示收錄的miRNA前體發(fā)夾序列數(shù)量。紅色箭頭表示二代測(cè)序技術(shù)開(kāi)始廣泛應(yīng)用于miRNA的檢測(cè)。在2005年，Lu等(Luetal.,2005)首次運(yùn)用小RNA測(cè)序技術(shù)從模式植物擬南芥的幼苗和花序中獲得超過(guò)兩百萬(wàn)條小RNA序列，極大地豐富了植物miRNA家族的數(shù)量和種類。自2007年，小RNA測(cè)序被應(yīng)用于更多物種miRNA的檢測(cè)，使得miRNA的挖掘速度得到了顯著提高（圖1.2）。最新版本miRNA權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase（release22：March2018）(Griffiths-Jonesetal.,2006)共收錄了271個(gè)物種的38589條miRNA前體發(fā)夾序列和48885條成熟miRNA序列。相比于V21版（release21:June2014），V22版數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的序列數(shù)量有了大幅度的提升：新增了10031條miRNA發(fā)夾前體序列和13149條成熟miRNA序列，序列數(shù)量增加超過(guò)三分之一。目前已可以使用芯片技術(shù)和高通量測(cè)序快速、高效地檢測(cè)和鑒定miRNA。從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)可知（圖1.2），借助這些技術(shù)，大量的miRNA被發(fā)現(xiàn)。然而，對(duì)

第2章利用小RNA測(cè)序分析伸長(zhǎng)棉纖維細(xì)胞中的miRNA162.3結(jié)果與分析2.3.1總RNA的提取與文庫(kù)構(gòu)建高質(zhì)量的總RNA是有效進(jìn)行小RNA文庫(kù)構(gòu)建的前提條件�？俁NA的純度、濃度及完整性等直接體現(xiàn)了所提取的RNA樣品質(zhì)量的高低。分別對(duì)四個(gè)時(shí)期棉纖維樣品提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，使用超微量微孔板分光光度計(jì)和Agilent2100生物分析儀測(cè)定樣品中RNA的純度和濃度，結(jié)果如表2.1所示。本實(shí)驗(yàn)中，四個(gè)時(shí)期棉纖維樣品的總RNA的OD260/OD280比值均在1.8~2.1之間，說(shuō)明RNA純度較高，可以排除來(lái)自蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)的干擾。四類樣品的濃度均大于2000ng/μL，且RNA總量均大于100μg、RIN值均大于8.5。表2.1四個(gè)棉花纖維樣品總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果樣品OD260/OD280濃度（ng/μL）體積（μL）總量(μg)28S/18SRINF51.8742129.91850106.49591.79.8F101.9232455.82450122.79121.88.5F151.9292033.87350101.69371.68.7F202.0672099.14650104.95731.68.8圖2.1陸地棉纖維伸長(zhǎng)期總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖DPA：開(kāi)花后天數(shù)；F5、F10、F15和F20分別代表開(kāi)花后5天、10天、15天和20天的纖維RNA樣品；箭頭分別指示28SrRNA、18SrRNA和tRNA的位置。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Molecular characterization and expression analysis of Triticum aestivum squamosa-promoter binding protein-box genes involved in ear development[J]. Bin Zhang,Xia Liu,Guangyao Zhao,Xinguo Mao,Ang Li,Ruilian Jing.  Journal of Integrative Plant Biology. 2014(06)
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