發(fā)布時間：2017-05-01 00:08

  本文關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)子調(diào)控紅松細(xì)胞合成松多酚機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：多酚是紅松中具有重要生理功能的次生代謝產(chǎn)物,可以提高機(jī)體抗氧化能力,有助于預(yù)防癌癥和心腦血管疾病的發(fā)生,在營養(yǎng)、健康、醫(yī)藥領(lǐng)域的關(guān)注度逐漸提高。因此研究紅松多酚合成代謝途徑及其調(diào)控手段具有重要的意義。本研究以組織培養(yǎng)紅松胚誘導(dǎo)生成的不定芽為實(shí)驗(yàn)材料,以8種誘導(dǎo)子(PHE、CA、MeJA、SA、CTS、YE、La、 Eu)為研究對象,以多酚和原花青素含量為指標(biāo),進(jìn)行誘導(dǎo)子的篩選工作,確立促進(jìn)紅松多酚合成最佳的誘導(dǎo)子以及最佳的誘導(dǎo)處理組合條件,進(jìn)一步分析誘導(dǎo)子對紅松氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)的影響；采用Illumina HiSeq技術(shù)對紅松進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,挖掘與多酚生物合成相關(guān)功能基因,分析紅松多酚的合成代謝途徑；采用RT-PCR技術(shù)分析誘導(dǎo)子對紅松多酚合成相關(guān)功能基因的表達(dá)影響,探究誘導(dǎo)子調(diào)控多酚合成的作用機(jī)制。主要的研究結(jié)果如下：在供試濃度范圍內(nèi),不同的誘導(dǎo)子對紅松不定芽的生長具有不同的生理作用,PHE、CTS、YE、La和Eu在合適的濃度范圍內(nèi)可以顯著促進(jìn)生長；CA、MeJA和SA明顯抑制生長；高濃度的PHE、CTS也會抑制生長。7種誘導(dǎo)子(PHE、MeJA、SA、 CTS、YE、La、Eu)在合適的濃度范圍內(nèi)可以顯著提高多酚和原花青素的積累量,促進(jìn)多酚物質(zhì)的合成,最佳的誘導(dǎo)濃度分別為2mmol/L PHE、10μmol/L MeJA、40μmol/L SA、100mg/LCTS、100mg/L YE、100μmol/L La和400μmol/L Eu。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,7種誘導(dǎo)子因素影響多酚積累量的顯著性大小依次為：CTSLaMeJAPHEEuS AYE,確定影響多酚積累量的3種關(guān)鍵因素為：CTS、 La、MeJA。通過對CTS+La+MeJA組合誘導(dǎo)條件進(jìn)行Box-Benhnken Design響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),優(yōu)化得到的最佳誘導(dǎo)條件為：CTS 79.58mg/L、La 42.21μmol/L、MeJA 16.63 μmol/L,預(yù)測多酚積累量最高可達(dá)到14.28mg/g FW,實(shí)際多酚積累量為13.42 mg/g FW,與對照組相比提高了122.19%。3種誘導(dǎo)子CTS、La、MeJA促進(jìn)多酚合成具有協(xié)同增效作用。3種誘導(dǎo)子MeJA、CTS、La以及CTS+ La+MeJA組合可以顯著激活紅松抗氧化防御反應(yīng)和苯丙烷代謝途徑,促進(jìn)多酚物質(zhì)合成與積累,誘導(dǎo)響應(yīng)時間和強(qiáng)度具有差異性。CTS+ La+MeJA組合誘導(dǎo)效果顯著優(yōu)于3種誘導(dǎo)子單獨(dú)使用,利用3種誘導(dǎo)子之間的協(xié)同作用,可以緩解MeJA對紅松不定芽生長的抑制作用；更大程度提高紅松氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)抗氧化酶(SOD、POD、CAT、PAL、C4H)的活性和增加抗氧化物質(zhì)(多酚、原花青素)的積累量。CTS+ La+MeJA作為外源誘導(dǎo)子通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)將誘導(dǎo)信號傳遞到細(xì)胞內(nèi),迅速刺激紅松不定芽的氧化應(yīng)激防御系統(tǒng),苯丙烷代謝途徑被活化,促進(jìn)了抗氧化物質(zhì)多酚的合成與積累。通過Illumina HiSeq技術(shù)對紅松不定芽進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析,獲得了13369359條contig,172608條unigene。將獲得的unigene與NR、GO、KOG和KEGG基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對和功能預(yù)測。其中58406(33.84%)條unigenes得到了功能注釋；17996條unigene歸納到GO數(shù)據(jù)庫的48個聚類中；26026條unigene被注釋到KOG數(shù)據(jù)庫的25個功能類別；9846條unigene歸入KEGG數(shù)據(jù)庫的334條生物學(xué)通路中；997條unigene參與了次生代謝生物合成。通過功能注釋發(fā)現(xiàn)有49條unigene參與了紅松多酚的生物合成,涉及了5條次生代謝生物合成途徑(苯丙烷生物合成途徑、類黃酮生物合成途徑、黃酮和黃酮醇生物合成途徑、花青素生物合成途徑、二苯乙烯生物合成途徑)和14個相關(guān)功能基因(PAL、C4H、4CL、CHS、F3H、F3'H、FLS、DFR、ANR、 LAR、UFGT、3-OMT、CCoAOMT、HCT)。CTS+La+MeJA處理組和對照組兩個紅松轉(zhuǎn)錄樣本進(jìn)行差異表達(dá)分析,篩選出5713條差異表達(dá)unigene,其中3449條unigene為表達(dá)上調(diào),2264條unigene為表達(dá)下調(diào),主要參與核糖體途徑、生化代謝途徑和次生代謝物的生物合成途徑。在差異表達(dá)文庫中篩選出與多酚合成相關(guān)的23條表達(dá)上調(diào)unigene編碼多酚合成途徑中8個功能基因(PAL、4CL、CHS、F3H、DFR、ANR、LAR和UFGT)。將這8個功能基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證和表達(dá)分析,誘導(dǎo)子(CTS、MeJA、La、CTS+La+MeJA)均可誘導(dǎo)8種功能基因顯著表達(dá),其中轉(zhuǎn)錄水平變化最大的為CHS,其次為ANR和LAR。初步證實(shí)CHS、 ANR、LAR為紅松多酚合成的關(guān)鍵功能基因。CTS+La+MeJA組合誘導(dǎo)紅松細(xì)胞CHS、ANR、LAR的上調(diào)表達(dá)最為顯著,分別是對照組的185、25、21倍。CTS+La+MeJA誘導(dǎo)提高總酚和總原花青素含量的同時,還可以顯著提高兒茶素、表兒茶素、原花青定B2和花旗松素4種單體酚的含量。CTS+La+MeJA誘導(dǎo)多酚合成關(guān)鍵酶基因CHS、ANR、LAR的高表達(dá)與多酚組分含量的增加具有正相關(guān)性。CTS+La+MeJA與紅松細(xì)胞相互作用,能夠快速激活細(xì)胞氧化應(yīng)激防御系統(tǒng),高度專一和選擇性地誘導(dǎo)紅松多酚生物合成關(guān)鍵功能基因(CHS、ANR、LAR)的表達(dá),最終促進(jìn)目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物多酚的合成和積累,從而達(dá)到調(diào)控多酚合成的目的。
【關(guān)鍵詞】：紅松多酚 誘導(dǎo)子 氧化應(yīng)激防御系統(tǒng) 基因表達(dá) 多酚合成代謝途徑
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S791.247
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-14
• 1 緒論14-27
• 1.1 植物多酚的研究進(jìn)展14-18
• 1.1.1 多酚的結(jié)構(gòu)與分類14-15
• 1.1.2 松多酚的結(jié)構(gòu)和功能特性15-16
• 1.1.3 多酚的生物合成途徑16-18
• 1.2 植物次生代謝合成調(diào)控的研究18-25
• 1.2.1 誘導(dǎo)子對植物次生代謝合成的調(diào)控作用20-22
• 1.2.2 誘導(dǎo)子促進(jìn)次生代謝合成的作用機(jī)制22-25
• 1.3 研究的目的和意義25-26
• 1.4 研究的主要內(nèi)容26-27
• 2 促進(jìn)紅松多酚合成誘導(dǎo)子的篩選27-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法27-28
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料27
• 2.1.2 紅松不定芽的培養(yǎng)27
• 2.1.3 誘導(dǎo)子處理27-28
• 2.1.4 多酚提取方法28
• 2.1.5 多酚含量測定方法28
• 2.1.6 原花青素含量測定方法28
• 2.1.7 數(shù)據(jù)處理28
• 2.2 結(jié)果及分析28-38
• 2.2.1 前體物質(zhì)(PHE、CA)對紅松多酚合成的影響28-30
• 2.2.2 植物激素(MeJA、SA)對紅松多酚合成的影響30-33
• 2.2.3 生物誘導(dǎo)子(CTS、YE)對紅松多酚合成的影響33-35
• 2.2.4 稀土元素(La、Eu)對紅松多酚合成的影響35-37
• 2.2.5 誘導(dǎo)子對松多酚合成誘導(dǎo)效果的對比分析37-38
• 2.3 本章小結(jié)38-39
• 3 Plackett-Burman和Box-Benhnken Design設(shè)計優(yōu)化促進(jìn)紅松多酚合成誘導(dǎo)條件的研究39-47
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法39-40
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料39
• 3.1.2 Plackett-Barman實(shí)驗(yàn)設(shè)計39
• 3.1.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計39-40
• 3.1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計40
• 3.1.5 數(shù)據(jù)處理40
• 3.2 結(jié)果與分析40-46
• 3.2.1 Plackett-Barman實(shí)驗(yàn)設(shè)計確定關(guān)鍵影響因素40-41
• 3.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)研究最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域41-42
• 3.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析42-44
• 3.2.4 誘導(dǎo)效果的對比44-46
• 3.3 本章小結(jié)46-47
• 4 誘導(dǎo)子對紅松氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)的影響47-54
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法47-48
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料47
• 4.1.2 氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)相關(guān)酶的提取方法47
• 4.1.3 氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)相關(guān)酶活測定方法47-48
• 4.1.4 數(shù)據(jù)處理48
• 4.2 結(jié)果與分析48-53
• 4.2.1 誘導(dǎo)子對紅松不定芽生長的影響48-49
• 4.2.2 誘導(dǎo)子對抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性的影響49-50
• 4.2.3 誘導(dǎo)子對PAL和C4H活性的影響50-52
• 4.2.4 誘導(dǎo)子對多酚和原花青素積累量的影響52-53
• 4.3 本章小結(jié)53-54
• 5 紅松轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建和Illumina HiSeq 2500測序54-69
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法54-56
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料54
• 5.1.2 測序文庫的構(gòu)建54-55
• 5.1.3 生物信息分析55-56
• 5.1.4 Unigene功能注釋56
• 5.2 結(jié)果與分析56-68
• 5.2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的組裝56-58
• 5.2.2 Unigene功能注釋58
• 5.2.3 GO數(shù)據(jù)庫注釋分析58-61
• 5.2.4 KOG數(shù)據(jù)庫注釋分析61-63
• 5.2.5 Unigene KEGG Pathway注釋分析63-68
• 5.3 本章小結(jié)68-69
• 6 誘導(dǎo)子調(diào)控紅松多酚合成基因表達(dá)及作用機(jī)制分析69-84
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法69-72
• 6.1.1 實(shí)驗(yàn)材料69
• 6.1.2 差異表達(dá)量計算69-70
• 6.1.3 RT-PCR分析多酚合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)70-72
• 6.1.4 HPLC法測定多酚組分含量72
• 6.2 結(jié)果與分析72-83
• 6.2.1 Unigene的差異表達(dá)分析72-73
• 6.2.2 差異表達(dá)基因GO顯著富集分析73-75
• 6.2.3 差異表達(dá)基因Pathway顯著富集分析75-79
• 6.2.4 誘導(dǎo)子對多酚合成相關(guān)基因表達(dá)的影響79-80
• 6.2.5 CTS+La+MeJA對紅松多酚合成的調(diào)控作用80-83
• 6.3 本章小結(jié)83-84
• 結(jié)論84-86
• 參考文獻(xiàn)86-101
• 附錄101-102
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文102-103
• 致謝103-104

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)子調(diào)控紅松細(xì)胞合成松多酚機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：337858