本文關鍵詞：弱毒突變體對野生型馬鈴薯X病毒的交叉保護及二者侵染本氏煙的轉(zhuǎn)錄組學分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)屬于馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus),主要侵染馬鈴薯、番茄、辣椒、煙草等茄科作物,引起嚴重的病害。如果PVX與馬鈴薯Y病毒屬的病毒共同侵染,會產(chǎn)生協(xié)生作用,引起更為嚴重的癥狀。近年來,關于PVX基因組結(jié)構(gòu)和功能、株系劃分、寄主抗病機制以及防治技術等方面研究較多,但是關于PVX弱毒突變體的篩選及致病機理的研究較少。本文以自主構(gòu)建的PVX侵染性克隆為基礎,利用定點突變的方法獲得突變體,然后從中篩選弱毒突變體,測定了其交叉保護效果;同時利用轉(zhuǎn)錄組測序技術分析野生型PVX和一個弱毒突變體侵染本氏煙后的基因表達差異;對弱毒突變體進行改造防治其他多種病毒。主要結(jié)果如下:利用反向遺傳學證明依賴于RNA的RNA聚合酶(RdRp)上四個氨基酸位點的突變都可以降低PVX的致病力。當把PVX RdRp第46位的Glu(E46)、第863位的Asn(N863)、第968位的Asn(N968)、第1001位的Glu(E1001)分別突變?yōu)锳la時都能減輕PVX在本氏煙上的癥狀。Western blotting和Northern blotting檢測結(jié)果表明,四個突變體在寄主體內(nèi)的濃度、正鏈和負鏈RNA的積累水平較野生型均明顯降低。測定了四個弱毒突變體對野生型PVX的交叉保護效果,研究了交叉保護作用機理。保護間隔期為5天時,四個突變體都沒有保護效果。當保護間隔期為10天時,突變體E1001A具有較好的交叉保護效果,保護效率為100%;E46A能延遲發(fā)病;N863A和N968A沒有保護效果。間隔期為15天時,E1001A具有較好的保護效果,保護效率為100%;E46A具有不完全的保護效果,保護效率為33.3%;N863A和N968A依然沒有明顯的保護效果。將E46和E1001同時突變?yōu)锳la,得到雙位點突變體dM,在間隔期為15天時,dM對PVX的保護效率為23.3%。利用Northern blotting檢測了弱毒突變體的siRNA積累水平,證明弱毒突變體的siRNA積累水平與之介導的抗性水平呈正相關,推測PVX弱毒突變體介導的交叉保護作用機制可能是由siRNA介導的。但是弱毒突變體也能表達衣殼蛋白(CP),因此不能完全排除CP在交叉保護中的作用。利用數(shù)字基因表達譜測序技術(DGE)分析了野生型PVX(Pwt)和弱毒突變體(Pat)侵染本氏煙后引發(fā)的基因表達差異。接種后第1天,Pwt使467個基因表達水平發(fā)生變化,GO分析顯示這些基因在DNA代謝過程、DNA復制、葉綠素生物合成過程、葉綠素代謝過程、色素生物合成過程、色素代謝過程、Mg螯合酶活性等幾個類別中呈現(xiàn)顯著的富集,KEGG分析顯示DNA復制為顯著富集的代謝通路。接種后第2天,Pwt使1160個基因表達水平發(fā)生變化,這些基因主要富集于光合作用、光合膜、類囊體、類囊體部分、光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II幾個類別中,顯著富集于光合作用-天線蛋白、光合作用和類胡蘿卜素生物合成幾個代謝通路。接種后第10天,Pwt使1693個基因表達發(fā)生變化,這些基因在生物過程分類中的生物過程、代謝過程、細胞過程、有機物質(zhì)代謝過程、初級代謝過程、細胞代謝過程、大分子代謝過程和細胞大分子代謝過程等類別中呈現(xiàn)最顯著的富集,KEGG分析顯示最顯著富集的途徑為核糖體。推測Pwt侵染可能首先利用了寄主的DNA復制和代謝系統(tǒng)完成自身的復制和增殖,同時也影響了光合色素相關的基因表達,使光合作用受到影響,從而使生物過程、代謝過程、細胞過程等過程發(fā)生了變化,最終導致癥狀的形成。對數(shù)據(jù)進一步分析發(fā)現(xiàn),Pwt系統(tǒng)侵染后大多數(shù)與葉綠素代謝相關的基因、類胡蘿卜素合成相關的基因都發(fā)生了顯著的上調(diào),大部分與纖維素合成相關的基因以及與細胞壁結(jié)構(gòu)相關的基因都發(fā)生了下調(diào),這些基因的變化可能是Pwt侵染引起花葉、皺縮癥狀的主要原因之一。此外,Pwt在侵染初期可能通過抑制水楊酸、茉莉酸信號轉(zhuǎn)導途徑從而打破了寄主抗性,在侵染后期使許多與泛素化系統(tǒng)相關的基因的表達都發(fā)生了顯著的變化,推測這些基因的變化使泛素化參與調(diào)控的植物生理反應受到影響,也可能是Pwt侵染引起嚴重癥狀的原因之一。通過對PVX弱毒突變體進行改造獲得了兼抗煙草花葉病毒(TMV)和馬鈴薯Y病毒(PVY)的弱毒疫苗。在TMV和PVY的基因組中各篩選幾個片段,分別克隆到弱毒突變體E1001A中進行交叉保護效果測定,發(fā)現(xiàn)TMV RdRp-2和PVY-7兩個片段分別能誘導對TMV和PVY較好的抗性。將篩選到的兩個最佳片段通過融合PCR聚合后重新連入PVX弱毒突變體E1001A中,得到二聯(lián)弱毒疫苗。溫室測定二聯(lián)疫苗對TMV和PVY介導的交叉保護效果,發(fā)現(xiàn)二聯(lián)弱毒疫苗對兩種病毒都表現(xiàn)出一定的抗性,對TMV的保護效率為33.3%,而對PVY的保護效率為44.4%。
【關鍵詞】：馬鈴薯X病毒 定點突變 弱毒突變體 交叉保護 轉(zhuǎn)錄組 差異表達基因 弱毒疫苗
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S432.41
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-15
• 1 引言15-29
• 1.1 交叉保護作用類型16-18
• 1.2 交叉保護作用機制18-20
• 1.2.1 衣殼蛋白介導的交叉保護作用18
• 1.2.2 RNA介導的交叉保護作用18-20
• 1.3 影響交叉保護作用的因素20-21
• 1.3.1 株系專化性20
• 1.3.2 溫度20
• 1.3.3 寄主因素20
• 1.3.4 保護間隔期20-21
• 1.3.5 挑戰(zhàn)病毒的接種量21
• 1.3.6 挑戰(zhàn)病毒的形式21
• 1.4 限制交叉保護應用的因素及解決措施21-22
• 1.5 馬鈴薯X病毒的研究現(xiàn)狀22-25
• 1.5.1 危害22
• 1.5.2 基因組的結(jié)構(gòu)與功能22-23
• 1.5.3 復制和表達23-24
• 1.5.4 株系劃分24-25
• 1.5.5 馬鈴薯X病毒與馬鈴薯Y病毒屬病毒的協(xié)生作用25
• 1.6 轉(zhuǎn)錄組學在病毒與寄主植物互作研究中的應用25-28
• 1.6.1 轉(zhuǎn)錄組學的研究方法26-28
• 1.6.2 轉(zhuǎn)錄組學在植物病毒研究中的應用28
• 1.7 本研究的目的意義28-29
• 2 材料與方法29-63
• 2.1 材料29
• 2.1.1 毒源的保存29
• 2.1.2 供試植物29
• 2.1.3 菌株29
• 2.1.4 血清29
• 2.1.5 酶與各種生化試劑29
• 2.1.6 寡聚核苷酸引物29
• 2.2 方法29-63
• 2.2.1 定點突變29-36
• 2.2.2 病毒接種36-38
• 2.2.3 RT-PCR檢測38-39
• 2.2.4 Western blotting檢測39-42
• 2.2.5 實時熒光定量PCR檢測42-45
• 2.2.6 Northern blotting檢測45-49
• 2.2.7 交叉保護效果測定49-50
• 2.2.8 siRNA積累水平的測定50-52
• 2.2.9 挑戰(zhàn)接種后強毒總RNA和siRNA積累水平的測定52-54
• 2.2.10 本氏煙的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析54-58
• 2.2.11 單聯(lián)弱毒疫苗的研制58-61
• 2.2.12 二聯(lián)弱毒疫苗的研制61-63
• 3 結(jié)果與分析63-105
• 3.1 PVX侵染性克隆的構(gòu)建63-64
• 3.2 PVX弱毒突變體的篩選及交叉保護效果64-79
• 3.2.1 突變質(zhì)粒的獲得64
• 3.2.2 突變體在本氏煙上的癥狀64-66
• 3.2.3 突變體對病毒積累水平的影響66
• 3.2.4 突變體對病毒RNA積累水平的影響66-67
• 3.2.5 突變體對病毒正鏈和負鏈RNA積累水平的影響67-68
• 3.2.6 弱毒突變體介導的交叉保護作用68-73
• 3.2.7 雙位點突變體在本氏煙上的癥狀73-74
• 3.2.8 雙位點突變體在本氏煙上介導的交叉保護效果74
• 3.2.9 弱毒突變體siRNA的積累量與其抗性水平的關系74-76
• 3.2.10 突變體E1001A的穩(wěn)定性76
• 3.2.11 突變體E1001A在普通煙上的癥狀及介導的交叉保護效果76-78
• 3.2.12 突變體E1001A在番茄上介導的交叉保護效果78-79
• 3.3 本氏煙的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析79-100
• 3.3.1 RNA的質(zhì)量檢測79
• 3.3.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析79-100
• 3.4 單聯(lián)弱毒疫苗的交叉保護效果100-103
• 3.4.1 單聯(lián)弱毒疫苗的構(gòu)建100-101
• 3.4.2 單聯(lián)弱毒疫苗介導的交叉保護效果101-103
• 3.5 二聯(lián)弱毒疫苗的交叉保護效果103-105
• 3.5.1 二聯(lián)弱毒疫苗的構(gòu)建103
• 3.5.2 二聯(lián)弱毒疫苗介導的交叉保護效果103-105
• 4 討論105-112
• 4.1 RdRp不同位點的突變影響病毒致病力的機制105
• 4.2 RNA沉默抑制子與病毒致病力的關系105-106
• 4.3 病毒產(chǎn)生的癥狀嚴重程度與病毒積累量的關系106
• 4.4 弱毒突變體的交叉保護作用106-107
• 4.5 Pwt和Pat侵染的本氏煙的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析107-110
• 4.6 二聯(lián)弱毒疫苗在防治病毒病上的應用110-112
• 5 結(jié)論112-113
• 參考文獻113-128
• 致謝128-129
• 攻讀博士期間發(fā)表論文情況129

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 徐雷;姜波;;病毒誘導的基因沉默技術(VIGS)在豌豆基因功能研究中的應用[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2013年29期

2 王心宇;呂坤;蔡彩平;徐君;郭旺珍;;TRV病毒介導的基因沉默體系在棉花中的建立及應用[J];作物學報;2014年08期

3 楊瑪麗;彭宏;陳天子;張保龍;趙統(tǒng)敏;余文貴;趙麗萍;;RNAi介導的轉(zhuǎn)基因番茄抗TYLCV研究[J];西南農(nóng)業(yè)學報;2014年06期

4 CHENG Chun-zhen;YANG Jia-wei;YAN Hu-bin;BEI Xue-jun;ZHANG Yong-yan;LU Zhi-ming;ZHONG Guang-yan;;Expressing p20 hairpin RNA of Citrus tristeza virus confers Citrus aurantium with tolerance/resistance against stem pitting and seedling yellow CTV strains[J];Journal of Integrative Agriculture;2015年09期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 申晚霞;植物病毒衛(wèi)星RNA干擾其輔助病毒致病性的分子機理[D];西南大學;2013年

2 張曉峰;蕪菁鄒縮病毒復制酶小亞基P28在重復侵染排斥中的功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2013年

3 孫書娥;番茄斑萎病毒的分離鑒定及表達dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2013年

4 卓濤;馬鈴薯卷葉病毒內(nèi)蒙古分離物抑制子P0關鍵氨基酸定位[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2014年

5 Chofong Gilbert Nchongboh;[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2014年

6 謝雪迎;嵌合基因結(jié)構(gòu)對發(fā)夾RNA介導的病毒抗性的影響及雙抗轉(zhuǎn)基因水稻新材料的培育[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2014年

7 吳根土;兩種植物病毒編碼的RNA沉默抑制子在寄主體內(nèi)的功能研究[D];浙江大學;2014年

  本文關鍵詞：弱毒突變體對野生型馬鈴薯X病毒的交叉保護及二者侵染本氏煙的轉(zhuǎn)錄組學分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：335713