本文關(guān)鍵詞：蝶蛹金小蜂寄生對寄主轉(zhuǎn)錄組的影響及三種毒蛋白分子特性分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：菜粉蝶為十字花科蔬菜重要的害蟲,其危害嚴(yán)重,蝶蛹金小蜂為菜粉蝶的蛹期優(yōu)勢寄生蜂(Hu,1983)。寄生蜂雌蜂將一種或多種寄生因子注入寄主體內(nèi),用來抑制寄主免疫、調(diào)控寄主生長發(fā)育和營養(yǎng)代謝等生理活動。這些寄生因子包括,毒液、多分DNA病毒(PDVs)、類病毒顆粒,卵巢蛋白等(Pennacchio et al.,2006)。在不含有PDVs的寄生蜂中,毒液為抑制寄主免疫的關(guān)鍵因子(Asgari et al.,2011)。寄生蜂除了能夠抑制寄主免疫外,還能夠通過影響寄主的神經(jīng)肽基因來間接影響寄主的發(fā)育(Shi et al.,2015)。前期研究表明,菜粉蝶蛹在注射蝶蛹金小蜂毒液30分鐘后其免疫反應(yīng)就能被抑制(Fang et al.,2010)。因此,本研究通過比較寄生1小時和未寄生的菜粉蝶蛹轉(zhuǎn)錄組,來探究寄生對寄主整體基因表達(dá)的影響。同時,對蝶蛹金小蜂的三個毒液蛋白的生理功能展開了研究。 1.通過比較分析寄生和非寄生的菜粉蝶蛹轉(zhuǎn)錄組,研究在寄生后的早期階段,寄主體內(nèi)整體基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化,特別是免疫相關(guān)基因的變化。通過拼接菜粉蝶蛹轉(zhuǎn)錄組,得到了45,639個轉(zhuǎn)錄本和27,659個非冗余Unigenes。Unigene的平均長度為790bp。27,659個Unigenes中,共有18,377個Unigene被成功注釋。同時,還鑒定出557個差異表達(dá)基因,其中有21個為免疫相關(guān)基因。寄生導(dǎo)致大部分模式識別受體基因表達(dá)被下調(diào),而絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達(dá)量被上調(diào)。本研究為蝶蛹金小蜂與其寄主菜粉蝶在分子水平上的互作研究奠定了理論基礎(chǔ)。 2.γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在生物體內(nèi)廣泛存在,γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶通常參與谷胱甘肽的代謝,在抗氧化、解毒和炎癥過程中起關(guān)鍵作用。通過分析蝶蛹金小蜂毒腺轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組,發(fā)現(xiàn)了一個可能編碼γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶蛋白(PpGGT)的基因序列。通過比較毒腺和殘體(不含毒腺)的轉(zhuǎn)錄組,發(fā)現(xiàn)PpGGT在毒腺中高表達(dá)。通過RACE技術(shù),克隆得到了PpGGT的基因序列。序列分析表明,編碼PpGGT的cDNA序列全長2274bp, ORF長1959bp,共編碼652個氨基酸殘基。采用Editseq軟件包對PpGGT基因序列進(jìn)行預(yù)測,其理論分子量大小為72196kDa,等電點為8.25。多序列比對顯示,PpGGT的成熟肽由大小兩個亞基組成。定量PCR、 Western blot(?)口免疫組化結(jié)果表明,PpGGT在蝶蛹金小蜂毒器官中高表達(dá),在其它組織中,幾乎檢測不到。PpGGT在羽化后1到6天的毒器官中都有表達(dá),第六天表達(dá)量最高。在毒液和重組表達(dá)的PpGGT中,都能夠檢測到GGT的活力。推測PpGGT能夠通過影響寄主體內(nèi)的谷胱甘肽代謝平衡,從而誘導(dǎo)血細(xì)胞的凋亡。 3.幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白存在于多種生物中,并參與多種重要的生理活動。我們通過分析蝶蛹金小蜂毒腺轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)了蝶蛹金小蜂幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(PpCBP)基因的部分序列。通過RACE技術(shù),克隆得到PpCBP的全長cDNA序列。PpCBP基因能夠編碼96個氨基酸,包括一個分泌信號肽和一個Peritrophin-A domain。進(jìn)化樹分析顯示PpCBP的幾丁質(zhì)結(jié)合功能域與麗蠅蛹集金小蜂的幾丁質(zhì)結(jié)合功能域以及墨吉對蝦卵巢膜聚為一類。定量PCR、 Western blot和免疫組織定位結(jié)果顯示,PpCBP在蝶蛹金小蜂毒器官中高表達(dá)。時間動態(tài)分析表明,PpCBP在蝶蛹金小蜂羽化后第4天的毒器官中表達(dá)量最高。結(jié)合測定結(jié)果表明,重組PpCBP能夠與幾丁質(zhì)相結(jié)合,而不能與纖維素相結(jié)合。蝶蛹金小蜂毒囊中含有幾丁質(zhì),因此推測PpCBP為毒囊的組成成分,并保護(hù)毒囊免受毒腺中活性組分的傷害。 4.絲氨酸蛋白酶同源物參與昆蟲的多種生理活動。通過分析蝶蛹金小蜂毒腺轉(zhuǎn)錄組,我們發(fā)現(xiàn)了蝶蛹金小蜂絲氨酸蛋白酶同源物(PpSPH29)的部分序列。通過比較毒腺和殘體(不含毒腺)的轉(zhuǎn)錄組,發(fā)現(xiàn)PpSPH29在毒腺中高表達(dá)。通過RACE技術(shù),從蝶蛹金小蜂毒腺中克隆獲得了PpSPH29的cDNA全長序列。PpSPH29基因全長1065bp,共編碼270個氨基酸。通過Editseq預(yù)測顯示,PpSPH29的等電點為4.4,分子量大小為29.4kDa。通過多序列比對發(fā)現(xiàn),PpSPH29在碳端含有一個催化活性域。其中,催化活性域中的第三個氨基酸殘基被替換為甘氨酸。定量PCR和Western blot的結(jié)果同樣證明,PpSPH29僅在毒器官中被檢測到,在其它組織中沒有檢測到。這些結(jié)果為深入研究寄生蜂毒液中絲氨酸蛋白酶同源物的功能奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：蝶蛹金小蜂 菜粉蝶 轉(zhuǎn)錄組 絲氨酸蛋白酶同源物 幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S476.3
【目錄】：

• 目錄7-10
• 致謝10-12
• 摘要12-14
• Abstract14-17
• 前言17-21
• 第一章 文獻(xiàn)綜述21-43
• 1.1 寄生蜂毒液蛋白21-37
• 1.1.1 寄生蜂毒液的理化性質(zhì)21-24
• 1.1.2 酶和酶抑制劑24-27
• 1.1.3 抗菌活性物質(zhì)27
• 1.1.4 麻痹毒素27-28
• 1.1.5 其它蛋白28-37
• 1.2 寄生蜂毒液的功能37-43
• 1.2.1 對寄主細(xì)胞免疫的影響37-39
• 1.2.2 對寄主體液免疫的影響39
• 1.2.3 調(diào)控寄主的生長發(fā)育39-41
• 1.2.4 破壞寄主的神經(jīng)系統(tǒng)41-43
• 第二章 蝶蛹金小蜂寄生對寄主菜粉蝶轉(zhuǎn)錄組的影響43-68
• 2.1 材料與方法43-49
• 2.1.1 供試?yán)ハx43
• 2.1.2 試劑與儀器43-44
• 2.1.3 RNA抽取44-45
• 2.1.4 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建和測序45
• 2.1.5 序列拼接和基因注釋45-46
• 2.1.6 差異表達(dá)基因46
• 2.1.7 差異表達(dá)基因GO富集分析和KEGG富集分析46-47
• 2.1.8 qRT-PCR驗證47-48
• 2.1.9 數(shù)據(jù)分析48-49
• 2.2 結(jié)果與分析49-66
• 2.2.1 高通量測序和De novo拼接49-50
• 2.2.2 非冗余Unigene的注釋與分類50-53
• 2.2.3 差異基因分析53
• 2.2.4 寄生對寄主免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響53-55
• 2.2.5 定量驗證55-66
• 2.3 討論66-68
• 第三章 蝶蛹金小蜂毒液γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(PpGGT)基因克隆與分子特性分析68-88
• 3.1 材料與方法68-78
• 3.1.1 供試?yán)ハx68
• 3.1.2 試劑與儀器68
• 3.1.3 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶活測定68-69
• 3.1.4 3 ’RACE和5’RACE69-70
• 3.1.5 序列拼接與分析70
• 3.1.6 原核表達(dá)與抗體制備70-72
• 3.1.7 組織表達(dá)分布72-73
• 3.1.8 時期表達(dá)分布73-74
• 3.1.9 真核表達(dá)74-76
• 3.1.10 數(shù)據(jù)分析76-78
• 3.2 結(jié)果與分析78-87
• 3.2.1 編碼蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpGGT基因克隆與序列分析78-81
• 3.2.2 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpGGT的原核表達(dá)與抗體制備81-82
• 3.2.3 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpGGT的組織分布82-84
• 3.2.4 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpGGT的時期分布84-85
• 3.2.5 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpGGT的真核表達(dá)與純化85
• 3.2.6 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶活測定85-87
• 3.3 討論87-88
• 第四章 蝶蛹金小蜂毒液幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(PpCBP)基因克隆與分子特性分析88-104
• 4.1 材料與方法88-94
• 4.1.1 供試?yán)ハx88
• 4.1.2 試劑與儀器88
• 4.1.3 3 ’RACE和5’RACE88-89
• 4.1.4 序列拼接與分析89
• 4.1.5 原核表達(dá)與抗體制備89-91
• 4.1.6 組織表達(dá)分布91
• 4.1.7 時期表達(dá)分布91
• 4.1.8 幾丁質(zhì)結(jié)合測定91-92
• 4.1.9 纖維素結(jié)合測定92
• 4.1.10 免疫組織化學(xué)92-93
• 4.1.11 數(shù)據(jù)分析93-94
• 4.2 結(jié)果與分析94-103
• 4.2.1 編碼蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpCBP基因克隆與序列分析94-97
• 4.2.2 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpCBP的原核表達(dá)與抗體制備97-98
• 4.2.3 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpCBP的組織分布98-99
• 4.2.4 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpCBP的時期分布99-100
• 4.2.5 組織定位100-101
• 4.2.6 幾丁質(zhì)和纖維素結(jié)合測定101-103
• 4.3 討論103-104
• 第五章 蝶蛹金小蜂毒液絲氨酸蛋白酶同源物(PpSPH29)基因克隆與分子特性分析104-114
• 5.1 材料與方法104-108
• 5.1.1 供試?yán)ハx104
• 5.1.2 試劑與儀器104
• 5.1.3 3 ’RACE和5’RACE104-105
• 5.1.4 序列拼接與分析105
• 5.1.5 原核表達(dá)與抗體制備105-106
• 5.1.6 組織表達(dá)分布106
• 5.1.7 數(shù)據(jù)分析106-108
• 5.2 結(jié)果與分析108-113
• 5.2.1 編碼蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpSPH29基因克隆與序列分析108-111
• 5.2.2 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpSPH29的原核表達(dá)與抗體制備111-112
• 5.2.3 蝶蛹金小蜂毒液蛋白PpSPH29的組織分布112-113
• 5.3. 討論113-114
• 總結(jié)114-116
• 一、小結(jié)114
• 二、本研究的特色和創(chuàng)新點114-115
• 三、不足之處及今后的研究方向115-116
• 參考文獻(xiàn)116-137
• 作者簡歷137

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：330611