瓜類細菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli,Ac）是一種種傳病菌,可感染西瓜、甜瓜、哈密瓜、南瓜、黃瓜、絲瓜等多種葫蘆科植物,導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收。該病菌的抗逆能力非常強,可在種子表面存活35年,并通過帶菌種子實現(xiàn)遠距離傳播。Ac可侵染果實、植株及種子,具有發(fā)病迅速、爆發(fā)性強、傳播快等特點,一旦感染會對瓜類產(chǎn)量帶來巨大經(jīng)濟損失,該病害是影響我國瓜類生產(chǎn)的主要病害之一。目前,檢測果斑病菌常用的方法為基于PCR的方法,該方法檢測靈敏度相對較高,但需要精密的熱循環(huán)儀,且需要3⁴ h才能獲得比較準確的結(jié)果。此方法需要在一個裝備齊全的實驗室中進行,不適用于病原菌的田間快速檢測。免疫學檢測方法,如酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）需要較長的孵育時間,不適用于田間快速檢測。而免疫學快速檢測方法,如免疫層析試紙條,其操作簡便、檢測時間短,不需要使用儀器,在田間病原菌的快速篩查上具有良好的應(yīng)用前景。為建立檢測果斑病菌的免疫學快速檢測方法,本課題首先制備了抗瓜類細菌性果斑病菌SD01的單克隆抗體,結(jié)果顯示:... 

【文章來源】：上海理工大學上海市

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

基于抗原標記的熒光免疫試紙條的原理圖

在優(yōu)化FITC濃度時,改良培養(yǎng)基中FITC的最高濃度為400μg/mL,需要對菌株的生長狀態(tài)進行評估。將過夜活化的SD01菌株,按照1:100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的腦心浸液培養(yǎng)基及添加FITC濃度為400μg/mL的改良培養(yǎng)基中,每間隔1h取200μL菌懸液加到酶標板中,測定600 nm波長處的OD值,并繪制生長曲線,結(jié)果如圖5-2所示。由圖可以看出,在改良的培養(yǎng)基中,菌株SD01的生長未受到明顯的抑制,在培養(yǎng)13 h后,與正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)的SD01菌株,OD值均可以達到1.0左右,即菌液濃度均可以達到4.5×109CFU/mL。5.3.2 最佳FITC濃度的優(yōu)化

隨后,選取另一系列FITC濃度(10μg/mL,15μg/mL,20μg/mL,25μg/mL,30μg/mL,35μg/mL,40μg/mL)添加到腦心浸液培養(yǎng)基中,對果斑病菌SD01培養(yǎng)。如圖5-3B所示,流式細胞儀測定不同F(xiàn)ITC濃度下細菌的熒光強度,比較各組間M3區(qū)域的比例發(fā)現(xiàn),當FITC濃度為20μg/mL時,細菌分布在M3區(qū)域的比例最高,因而20μg/mL作為單次實驗結(jié)果中細菌培養(yǎng)時最佳FITC濃度。重復(fù)三次測定細菌熒光強度的結(jié)果如圖5-4所示,菌株SD01在不同F(xiàn)ITC濃度的改良培養(yǎng)基中的總熒光標記率(M2+M3+M4)如圖5-4A所示,由圖可以看出,在FITC濃度低于200μg/mL時,細菌總熒光標記率可達到95%以上;分布在M3區(qū)域熒光細菌的比例如圖5-4B所示,當FITC濃度為20μg/mL時,M3區(qū)域的熒光細菌的比例顯著高于15μg/mL,因而最佳的改良培養(yǎng)基中FITC濃度為20μg/mL。


本文編號：3258664