CUP-SHAPED COTYLEDON 2（CUC2）基因是植物NAC（NAM/ATAF/CUC）家族轉(zhuǎn)錄因子之一,其在頂端分生組織的形成、器官生長(zhǎng)位置及邊界的確立、腋生分生組織形成和葉形變異等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前,該基因的功能挖掘大多集中在模式植物中,而在木本植物中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究團(tuán)隊(duì)前期在對(duì)兩種不同葉形和株型的樺樹,裂葉樺（Betula pendula’Dalecarlica’）和歐洲白樺Betula pendula),葉片轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)眾多關(guān)鍵基因,其中BpCUC2基因在裂葉樺中顯著上調(diào)表達(dá)。為了揭示BpCUC2的分子功能,本研究對(duì)該基因進(jìn)行了組織表達(dá)特性、生物信息學(xué)分析,對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行表型特性分析和解剖學(xué)觀察,并采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、酵母單雜交（Yeast one-hybrid）和 ChIP-PCR（Chromatin Immunoprecipitation-PCR）等技術(shù)篩選和驗(yàn)證其上游及下游調(diào)控基因。另外,對(duì)該基因的上游調(diào)控基因BpmiR164（BpmicroRNA164）進(jìn)行了組織表達(dá)特性和生物信息學(xué)分析,并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果如下:（1）生物信息學(xué)和組... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖１－５技術(shù)路線??Ｆｉｇｕｒｅ?１－５?Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ?ｒｏｕｔｅ??

?２?ＢｐＣＵＣ２基因功能研究???２．３．２?ＢｐＣＵＣ２轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位??暗培養(yǎng)一天后的洋蔥表皮于激光共聚焦下觀察，結(jié)果顯示：用陽(yáng)性質(zhì)粒??ＰＣＡＭＢＩＡ１３００轟擊的洋蔥表皮細(xì)胞中細(xì)胞膜和細(xì)胞核中均能觀察到ＧＦＰ綠色熒光，而??用３５Ｓ：：ＢｐＣＵＣ２質(zhì)粒轟擊的洋蔥表皮細(xì)胞中，ＧＦＰ綠色熒光只在細(xì)胞核中能被觀察??到，說(shuō)明ＢｐＣＵＣ２轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中。??圖２－４?ＢｐＣＵＣ２轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位??Ｆｉｇｕｒｅ?２－４?Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ?ｌｏｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＢｐＣＵＣ２??２．３．３?ＢｐＣＵＣ２轉(zhuǎn)錄激活域研究??２．３．３．１?ｐＧＢＫＴ７－ＢｐＣＵＣ２?載建??以?ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＢｐＣＵＣ２?質(zhì)粒為模板，以?ＢＤ－ＣＵＣ２－Ｆ?和?ＢＤ－ＣＵＣ２－Ｒ?為引物進(jìn)??行ＰＣＲ，電泳結(jié)果如圖２－５所示，結(jié)果顯示擴(kuò)增序列長(zhǎng)度與目的片段長(zhǎng)度一致。??＿??Ｍ，?ＤＮＡＭａｒｋｅｒ，ＤＬ２０００；泳道?１，水對(duì)照；泳道?２，ＢｐＣＵＣ２ＰＣＲ?產(chǎn)物??Ｍ，?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?ＤＬ２０００；?Ｌａｎｅ?１，?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?（ｔｅｍｐｌａｔｅ?ｉｓ?ｄｄＨ２〇）；?Ｌａｎｅ?２，?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ??ＢｐＣＵＣ２??圖２－５?ＰＣＲ擴(kuò)增辦ＣＵＣ２序列??Ｆｉｇｕｒｅ?２－５?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＢｐＣＵＣ２?ｇｅｎｅ??將辦ＣｉＴＣ２序列進(jìn)行ＰＣＲ產(chǎn)物膠回收，與酶切后的ｐＧＢＫＴ７載體進(jìn)行同源重組連??接，連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ＤＨ５ａ大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取在卡那霉素抗性平板上生長(zhǎng)的??菌落進(jìn)行菌液ＰＣＲ，上游引物使用ＢＤ

７空載體（陰性對(duì)照）轉(zhuǎn)入大腸桿菌ＤＨ５ａ大腸桿菌感受態(tài)細(xì)??胞，挑取在卡那霉素抗性平板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行菌液ＰＣＲ，上游引物采用ＢＤ－ＣＵＣ２－??Ｆ，下游引物使用通用引物Ｔ７－Ｒ，將ＰＣＲ條帶位置正確的菌液送測(cè)序，將測(cè)序正確菌??液提取質(zhì)粒，置于－２０°Ｃ保存?zhèn)溆谩??分別將構(gòu)建好的辦不同區(qū)段與ｐＧＢＫＴ７載體連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Ｙ２Ｈ酵母感受??態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的酵母感受態(tài)細(xì)胞涂布于ＳＤ／－Ｔｒｐ和ＳＤ／－Ｔｒｐ／Ｘ－ａ－Ｇａ丨培養(yǎng)基上，通??過(guò)顯色情況判斷其是否具有自激活作用，結(jié)果如圖２－８所示：??ＳＤＭＴ?迎＇－—■＊＂＊??己－Ｊ?□?Ｑ??Ｉ?８Ｄ?：：遍?ＮＡＣ?ｄｏｍａｉｎ??１０６５?□?□??；ｎｊｐ?ＢＤｌ?Ｆ／Ｒ?４２６?□?□??ｆ?ＢＤ?Ｉ?１?｜?１０６５?〇?□??「—『：兩—?????—｜?ＢＤ３?Ｆ／Ｒ?｜?９０６?□?□??｜??ＢＤ４?Ｆ／Ｒ?７４７??Ｅｐ５?Ｆ／Ｒ?Ｌ＇二二??Ｕ?．．：，ｇ碟１３?二］５８８?Ｄ?Ｄ??圖２－８辦Ｃｆ／Ｃ２轉(zhuǎn)錄因子不同區(qū)段自激活檢測(cè)及結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇｕｒｅ?２－８?Ｔｈｅ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?ｒｅｇｉｏｎ?ｏｆ?ＢｐＣＵＣ２??從圖中可以看出，辦ＣＣ／Ｃ２基因的５個(gè)區(qū)域片段中具有轉(zhuǎn)錄自激活活性的區(qū)域?yàn)榘??基酸的Ｃ端，因此ＢＰＣＵＣ２轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄自激活區(qū)域位于該基因的Ｃ端。隨著進(jìn)一??步縮短Ｃ端的片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化ｐＧＢＫＴ７－氨基酸片段ＢＤ３?（４２７－９０６?ｂｐ）的酵母可??以在ＳＤ／－Ｔｒｐ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)且在ＳＤ／－Ｔｒｐ／Ｘ－ａ－Ｇａｌ培養(yǎng)基上變藍(lán)，但當(dāng)ＢＤ３截短為ＢＤ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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