狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起的一種人獸共患病,以感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system,CNS）并造成嚴重神經(jīng)癥狀為主要特征,一旦發(fā)病致死率高達100%。全世界每年大約60,000人死于該病,其中受影響最為嚴重的是印度和中國。針對該病通過疫苗接種預防為主,目前尚無有效的治療藥物。RABV的已知受體包括乙酰膽堿受體、神經(jīng)細胞粘附分子以及低親和力的神經(jīng)營養(yǎng)因子受體等,但是研究表明它們都不能在體內(nèi)對病毒感染起決定性作用。對于一種多受體病毒,還存在有其他未知的宿主因子在RABV侵染過程中發(fā)揮受體功能。本團隊前期研究工作利用人類全基因組RNA干擾文庫從HEK-293細胞中篩選出代謝型谷氨酸受體2型（Metabotropic glutamate receptors type 2,mGluR2）。mGluR2屬于C類G蛋白偶聯(lián)受體家族（GPCRs）中的II型代謝型谷氨酸受體,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達水平相對較高,其表達或功能異常將導致一系列的神經(jīng)退行性疾病。但是目前尚無研究發(fā)現(xiàn)mGluR2在RABV入侵宿主細胞過程中發(fā)揮的作用。因此本研究目的首先... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 狂犬病的流行病學
    1.2 狂犬病的臨床癥狀
    1.3 RABV致病機理
        1.3.1 RABV感染CNS造成的結構損傷及其機制
        1.3.2 RABV造成神經(jīng)功能紊亂的機制
    1.4 RABV分子病原學
    1.5 RABV的入侵過程
    1.6 RABV受體研究進展
        1.6.1 尼古丁乙酰膽堿受體
        1.6.2 神經(jīng)細胞粘連分子受體
        1.6.3 低親和力的神經(jīng)生長因子受體
        1.6.4 其它可能受體
    1.7 代謝型谷氨酸受體研究進展
        1.7.1 mGluRs分類
        1.7.2 mGluRs的結構
        1.7.3 mGluR2的生理功能及其相關的神經(jīng)性疾病
        1.7.4 mGluRs激活的下游信號以及內(nèi)吞過程的研究進展
    1.8 本研究目的意義
第二章 mGluR2在RABV入侵宿主細胞過程中發(fā)揮作用的鑒定
    2.1 材料和方法
        2.1.1 細胞
        2.1.2 載體質(zhì)粒和病毒
        2.1.3 抗體、可溶性蛋白和siRNA
        2.1.4 其它試劑耗材
        2.1.5 主要儀器設備
        2.1.6 試劑配制
        2.1.7 不同物種mGluR2同源性分析
        2.1.8 病毒的制備和滴定
        2.1.9 RNA干擾試驗
        2.1.10 siRNA細胞毒性檢測試驗
        2.1.11 Trizol法提取細胞總RNA
        2.1.12 熒光定量PCR（qRT-PCR）
        2.1.13 間接免疫熒光檢測mGluR2-mCherry的表達
        2.1.14 Western Blotting (WB)檢測
        2.1.15 WB檢測mGluR2-mCherry的表達
        2.1.16 激光共聚焦試驗檢測mGluR2-mCherry膜表面表達情況
        2.1.17 細胞膜蛋白的提取及鑒定
        2.1.18 過表達mGluR2后病毒生長曲線測定
    2.2 結果
        2.2.1 不同物種mGluR2相似性分析
        2.2.2 沉默mGluR2抑制了ERA-eGFP在HEK-293 細胞中的復制
        2.2.3 沉默mGluR2抑制了ERA-eGFP在N2a細胞中的復制
        2.2.4 沉默mGluR2抑制了ERA-eGFP在SK-N-SH細胞中的復制
        2.2.5 沉默mGluR2抑制了VSV-eGFP在HEK-293 細胞中的復制
        2.2.6 過表達mGluR2-mCherry的驗證
        2.2.7 利用WB分析細胞膜表面mGluR2表達情況
        2.2.8 過表達mGluR2-mCherry促進ERA-eGFP感染HEK-293 細胞
    2.3 討論
第三章 mGluR2作為RABV入侵宿主細胞受體的鑒定
    3.1 材料和方法
        3.1.1 質(zhì)粒和病毒
        3.1.2 抗體和試劑
        3.1.3 實驗動物
        3.1.4 儀器設備
        3.1.5 檢測細胞沉淀中的蛋白互作
        3.1.6 pGEX-4T-mGluR2和p ET-28a-ERAG重組表達載體的構建
        3.1.7 mGluR2-GST與ERAG-His的可溶性表達
        3.1.8 可溶性重組蛋白的純化
        3.1.9 純化蛋白的濃度的檢測
        3.1.10 驗證蛋白間存在直接相互作用
        3.1.11 小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元細胞的制備培養(yǎng)
        3.1.12 抗體阻斷病毒感染試驗
        3.1.13 抗體競爭性Pulldown試驗
        3.1.14 可溶性蛋白體外中和病毒感染試驗
        3.1.15 mGluR2-GST中和病毒感染小鼠試驗
    3.2 結果
        3.2.1 ERAG與mGluR2之間存在相互作用
        3.2.2 RABV強毒株和街毒株囊膜糖與mGluR2之間存在相互作用
        3.2.3 mGluR2與RABV G蛋白的相互作用具有種屬特異性
        3.2.4 mGluR2-GST和ERAG-His誘導表達和SDS-PAGE分析
        3.2.5 mGluR2-GST和ERAG-His可溶性蛋白的純化
        3.2.6 RABVG蛋白與mGluR2存在直接的相互作用
        3.2.7 針對mGluR2抗體阻斷ERA-eGFP感染HEK-293 細胞
        3.2.8 針對mGluR2抗體阻斷ERA-eGFP感染神經(jīng)細胞
        3.2.9 針對mGluR2抗體阻斷ERA-eGFP體外感染的機制
        3.2.10 mGluR2可溶性蛋白封閉ERA體外感染
        3.2.11 mGluR2可溶性蛋白封閉GX09街毒株體內(nèi)感染試驗
    3.3 討論
第四章 RABV利用mGluR2進行內(nèi)吞的機制研究
    4.1 材料和方法
        4.1.1 病毒
        4.1.2 抗體試劑
        4.1.3 儀器設備
        4.1.4 檢測RABV感染對于細胞表面mGluR2表達水平的影響
        4.1.5 檢測RABV與mGluR2在HEK293中共定位
        4.1.6 酸性條件下mGluR2與ERA G蛋白之間的互作
        4.1.7 檢測沉默 β-arrestins2基因表達對RABV感染HEK-293 的影響
        4.1.8 體外感染RABV后檢測胞內(nèi)c AMP的變化
        4.1.9 mGluR2激活劑和抑制劑對于RABV體外感染的影響
    4.2 結果
        4.2.1 RABV感染促進了mGluR2的內(nèi)吞
        4.2.2 RABV與mGluR2在早期和晚期內(nèi)吞體中發(fā)生共定位
        4.2.3 沉默 β-arrestins2基因表達促進RABV感染HEK-293
        4.2.4 感染RABV對于胞內(nèi)c AMP濃度的影響
        4.2.5 mGluR2激活劑和抑制劑對于RABV體外感染的影響
    4.3 討論
第五章 全文結論
參考文獻
致謝
個人簡歷



本文編號：3191126