狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起的一種人獸共患病,以感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system,CNS）并造成嚴(yán)重神經(jīng)癥狀為主要特征,一旦發(fā)病致死率高達(dá)100%。全世界每年大約60,000人死于該病,其中受影響最為嚴(yán)重的是印度和中國(guó)。針對(duì)該病通過(guò)疫苗接種預(yù)防為主,目前尚無(wú)有效的治療藥物。RABV的已知受體包括乙酰膽堿受體、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子以及低親和力的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體等,但是研究表明它們都不能在體內(nèi)對(duì)病毒感染起決定性作用。對(duì)于一種多受體病毒,還存在有其他未知的宿主因子在RABV侵染過(guò)程中發(fā)揮受體功能。本團(tuán)隊(duì)前期研究工作利用人類全基因組RNA干擾文庫(kù)從HEK-293細(xì)胞中篩選出代謝型谷氨酸受體2型（Metabotropic glutamate receptors type 2,mGluR2）。mGluR2屬于C類G蛋白偶聯(lián)受體家族（GPCRs）中的II型代謝型谷氨酸受體,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)水平相對(duì)較高,其表達(dá)或功能異常將導(dǎo)致一系列的神經(jīng)退行性疾病。但是目前尚無(wú)研究發(fā)現(xiàn)mGluR2在RABV入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮的作用。因此本研究目的首先... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 狂犬病的流行病學(xué)
    1.2 狂犬病的臨床癥狀
    1.3 RABV致病機(jī)理
        1.3.1 RABV感染CNS造成的結(jié)構(gòu)損傷及其機(jī)制
        1.3.2 RABV造成神經(jīng)功能紊亂的機(jī)制
    1.4 RABV分子病原學(xué)
    1.5 RABV的入侵過(guò)程
    1.6 RABV受體研究進(jìn)展
        1.6.1 尼古丁乙酰膽堿受體
        1.6.2 神經(jīng)細(xì)胞粘連分子受體
        1.6.3 低親和力的神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體
        1.6.4 其它可能受體
    1.7 代謝型谷氨酸受體研究進(jìn)展
        1.7.1 mGluRs分類
        1.7.2 mGluRs的結(jié)構(gòu)
        1.7.3 mGluR2的生理功能及其相關(guān)的神經(jīng)性疾病
        1.7.4 mGluRs激活的下游信號(hào)以及內(nèi)吞過(guò)程的研究進(jìn)展
    1.8 本研究目的意義
第二章 mGluR2在RABV入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用的鑒定
    2.1 材料和方法
        2.1.1 細(xì)胞
        2.1.2 載體質(zhì)粒和病毒
        2.1.3 抗體、可溶性蛋白和siRNA
        2.1.4 其它試劑耗材
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
        2.1.6 試劑配制
        2.1.7 不同物種mGluR2同源性分析
        2.1.8 病毒的制備和滴定
        2.1.9 RNA干擾試驗(yàn)
        2.1.10 siRNA細(xì)胞毒性檢測(cè)試驗(yàn)
        2.1.11 Trizol法提取細(xì)胞總RNA
        2.1.12 熒光定量PCR（qRT-PCR）
        2.1.13 間接免疫熒光檢測(cè)mGluR2-mCherry的表達(dá)
        2.1.14 Western Blotting (WB)檢測(cè)
        2.1.15 WB檢測(cè)mGluR2-mCherry的表達(dá)
        2.1.16 激光共聚焦試驗(yàn)檢測(cè)mGluR2-mCherry膜表面表達(dá)情況
        2.1.17 細(xì)胞膜蛋白的提取及鑒定
        2.1.18 過(guò)表達(dá)mGluR2后病毒生長(zhǎng)曲線測(cè)定
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 不同物種mGluR2相似性分析
        2.2.2 沉默mGluR2抑制了ERA-eGFP在HEK-293 細(xì)胞中的復(fù)制
        2.2.3 沉默mGluR2抑制了ERA-eGFP在N2a細(xì)胞中的復(fù)制
        2.2.4 沉默mGluR2抑制了ERA-eGFP在SK-N-SH細(xì)胞中的復(fù)制
        2.2.5 沉默mGluR2抑制了VSV-eGFP在HEK-293 細(xì)胞中的復(fù)制
        2.2.6 過(guò)表達(dá)mGluR2-mCherry的驗(yàn)證
        2.2.7 利用WB分析細(xì)胞膜表面mGluR2表達(dá)情況
        2.2.8 過(guò)表達(dá)mGluR2-mCherry促進(jìn)ERA-eGFP感染HEK-293 細(xì)胞
    2.3 討論
第三章 mGluR2作為RABV入侵宿主細(xì)胞受體的鑒定
    3.1 材料和方法
        3.1.1 質(zhì)粒和病毒
        3.1.2 抗體和試劑
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.4 儀器設(shè)備
        3.1.5 檢測(cè)細(xì)胞沉淀中的蛋白互作
        3.1.6 pGEX-4T-mGluR2和p ET-28a-ERAG重組表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.7 mGluR2-GST與ERAG-His的可溶性表達(dá)
        3.1.8 可溶性重組蛋白的純化
        3.1.9 純化蛋白的濃度的檢測(cè)
        3.1.10 驗(yàn)證蛋白間存在直接相互作用
        3.1.11 小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元細(xì)胞的制備培養(yǎng)
        3.1.12 抗體阻斷病毒感染試驗(yàn)
        3.1.13 抗體競(jìng)爭(zhēng)性Pulldown試驗(yàn)
        3.1.14 可溶性蛋白體外中和病毒感染試驗(yàn)
        3.1.15 mGluR2-GST中和病毒感染小鼠試驗(yàn)
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 ERAG與mGluR2之間存在相互作用
        3.2.2 RABV強(qiáng)毒株和街毒株囊膜糖與mGluR2之間存在相互作用
        3.2.3 mGluR2與RABV G蛋白的相互作用具有種屬特異性
        3.2.4 mGluR2-GST和ERAG-His誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析
        3.2.5 mGluR2-GST和ERAG-His可溶性蛋白的純化
        3.2.6 RABVG蛋白與mGluR2存在直接的相互作用
        3.2.7 針對(duì)mGluR2抗體阻斷ERA-eGFP感染HEK-293 細(xì)胞
        3.2.8 針對(duì)mGluR2抗體阻斷ERA-eGFP感染神經(jīng)細(xì)胞
        3.2.9 針對(duì)mGluR2抗體阻斷ERA-eGFP體外感染的機(jī)制
        3.2.10 mGluR2可溶性蛋白封閉ERA體外感染
        3.2.11 mGluR2可溶性蛋白封閉GX09街毒株體內(nèi)感染試驗(yàn)
    3.3 討論
第四章 RABV利用mGluR2進(jìn)行內(nèi)吞的機(jī)制研究
    4.1 材料和方法
        4.1.1 病毒
        4.1.2 抗體試劑
        4.1.3 儀器設(shè)備
        4.1.4 檢測(cè)RABV感染對(duì)于細(xì)胞表面mGluR2表達(dá)水平的影響
        4.1.5 檢測(cè)RABV與mGluR2在HEK293中共定位
        4.1.6 酸性條件下mGluR2與ERA G蛋白之間的互作
        4.1.7 檢測(cè)沉默 β-arrestins2基因表達(dá)對(duì)RABV感染HEK-293 的影響
        4.1.8 體外感染RABV后檢測(cè)胞內(nèi)c AMP的變化
        4.1.9 mGluR2激活劑和抑制劑對(duì)于RABV體外感染的影響
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 RABV感染促進(jìn)了mGluR2的內(nèi)吞
        4.2.2 RABV與mGluR2在早期和晚期內(nèi)吞體中發(fā)生共定位
        4.2.3 沉默 β-arrestins2基因表達(dá)促進(jìn)RABV感染HEK-293
        4.2.4 感染RABV對(duì)于胞內(nèi)c AMP濃度的影響
        4.2.5 mGluR2激活劑和抑制劑對(duì)于RABV體外感染的影響
    4.3 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3191126