發(fā)布時間：2021-05-17 04:39

　　毛色是家畜重要的質量性狀之一,與MC1R基因調控黑色素的合成相關。家兔作為毛用、皮用和實驗動物,其毛皮顏色與其經濟價值密切相關。為此,本研究應用CRISPR/Cas9基因編輯技術,對敲除家兔MC1R基因獲得新毛色家兔的可行性進行了探討,研究主要取得如下結果:1、兔MC1R基因編碼區(qū)的克隆與分析本研究對蓮山黑兔、福建黃兔、新西蘭大白兔、巨灰兔和巨型格仔兔的MC1R基因完整CDS區(qū)進行了PCR擴增,測序結果顯示擴增片段與Gen Bank上發(fā)布的兔MC1R的CDS序列一致。隨后對上述CDS序列進行了生物信息學分析:不同毛色兔MC1R基因的多重序列比對結果顯示巨灰兔沒有缺失突變,等位基因屬于野生型E;蓮山黑兔、新西蘭大白兔和巨型格仔兔存在c.281＿286del缺失,等位基因屬于黑色顯性上位型E^D;福建黃兔存在c.304＿333del缺失,等位基因屬于隱性黃/紅色型e。2、CRSIPR/Cas9介導的MC1R基因敲除效率檢測本研究根據(jù)蓮山黑兔MC1R基因CDS區(qū)的測序結果和蛋白質結構預測,在第二和第五個跨膜結構域上設計了兩條sg RNA靶序列,成功構建了CRISPR/Ca... 

【文章來源】：廣西大學廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：157 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞表
第一部分 文獻綜述
    第一章 哺乳動物毛色形成機制
        1.1 黑色素形成過程
        1.2 影響黑色素生成的分子途徑
        1.3 毛干中的黑色素生成
        1.4 角質形成細胞與黑色素的轉運
        1.5 黑色素生成中的分子調控
            1.5.1 α-MSH的調控
            1.5.2 MITF的調控
            1.5.3 Wnt信號通路的調控
            1.5.4 PKC家族的調控
            1.5.5 EDN信號通路的調控
            1.5.6 SOX家族的調控
            1.5.7 PAX3的調控
        1.6 黑色素調控基因的變異與動物毛色決定
            1.6.1 MC1R和 ASIP基因
            1.6.2 KIT基因
            1.6.3 TYRP1基因
            1.6.4 MITF基因
            1.6.5 EDNRB基因
        1.7 小結與展望
    第二章 MC1R基因的研究進展
        2.1 MC1R的結構
        2.2 MC1R活性調節(jié)
        2.3 MC1R下游信號通路與第二信使CAMP
            2.3.1 MC1R與色素沉積
            2.3.2 MC1R的紫外線保護作用
        2.4 MC1R的激素信號調節(jié)
        2.5 MC1R基因的多態(tài)性與動物毛色形成
            2.5.1 牛
            2.5.2 豬
            2.5.3 犬科動物
            2.5.4 馬
            2.5.5 羊
            2.5.6 兔
        2.6 小結與展望
    第三章 CRISPR基因編輯系統(tǒng)的研究進展
        3.1 基因編輯系統(tǒng)的發(fā)展歷程
            3.1.1 第一代基因編輯系統(tǒng):ZFN
            3.1.2 第二代基因編輯系統(tǒng):TALEN
            3.1.3 第三代基因編輯系統(tǒng):CRISPR
        3.2 CRISPR基因編輯系統(tǒng)在生命科學基礎研究中的應用
            3.2.1 基因敲除
            3.2.2 基因敲入
            3.2.3 單堿基基因編輯
            3.2.4 染色體缺失、重排和核型工程
            3.2.5 基因驅動
            3.2.6 抑制靶基因表達
            3.2.7 激活靶基因表達
            3.2.8 染色質結構成像、RNA轉錄和蛋白質定位跟蹤
            3.2.9 RNA的基因編輯
            3.2.10 質粒的克隆和誘變
        3.3 CRISPR基因編輯系統(tǒng)在畜牧業(yè)中的應用
            3.3.1 提高家畜經濟性狀
            3.3.2 提高家畜繁殖力和抗病性
            3.3.3 提高畜產品質量
            3.3.4 提高動物福利
        3.4 CRISPR/CAS9 基因編輯系統(tǒng)在家兔中的應用
        3.5 本研究的目的與意義
第二部分 試驗研究
    第四章 兔MC1R基因編碼區(qū)的克隆與分析
        前言
        4.1 試驗材料及儀器設備
            4.1.1 組織材料、菌株和載體
            4.1.2 試驗試劑
            4.1.3 儀器設備
            4.1.4 主要培養(yǎng)基和溶液的配制
        4.2 試驗方法
            4.2.1 基因組DNA的提取
            4.2.2 引物的設計與合成
            4.2.3 目的基因編碼序列的擴增
            4.2.4 目的產物的回收與純化
            4.2.5 目的片段的連接與轉化
            4.2.6 質粒的提取
            4.2.7 雙酶切鑒定陽性重組質粒
            4.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
        4.3 試驗結果
            4.3.1 不同毛色兔MC1R基因CDS區(qū) PCR擴增結果
            4.3.2 不同毛色兔MC1R基因編碼區(qū)序列測定結果
            4.3.3 兔MC1R基因的生物信息學分析
        4.4 討論
        4.5 結論
    第五章 CRSIPR/CAS9 介導的MC1R基因敲除效率檢測
        前言
        5.1 試驗材料及儀器設備
            5.1.1 試驗材料、菌株和載體
            5.1.2 試驗試劑
            5.1.3 儀器設備
            5.1.4 主要培養(yǎng)基和溶液的配制
        5.2 試驗方法
            5.2.1 MC1R基因靶序列的設計與合成
            5.2.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)相關載體的構建
            5.2.3 質粒的轉化及鑒定
            5.2.4 去內毒提取質粒
            5.2.5 細胞的復蘇與培養(yǎng)
            5.2.6 Cas9 載體、sg RNA載體和RGS報告載體共轉293T細胞
            5.2.7 Cas9 載體和sg RNA載體共轉兔胎兒成纖維(RFF)細胞
            5.2.8 細胞基因組的提取
            5.2.9 體外轉錄模板的制備
            5.2.10 sgRNA的體外轉錄
            5.2.11 Cas9 m RNA的體外轉錄
            5.2.12 母兔的超排處理與胚胎收集
            5.2.13 受精卵的胞質注射
            5.2.14 PCR擴增單個胚胎目的序列檢測突變效率
            5.2.15 T7E1酶切檢測突變效率
            5.2.16 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
        5.3 試驗結果
            5.3.1 兔MC1R基因sg RNA的設計及CRISPR/Cas9 相關表達載體的構建
            5.3.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在293T細胞上的活性驗證
            5.3.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在兔胎兒成纖維細胞上的活性驗證
            5.3.4 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在兔胚胎水平敲除效率的驗證
        5.4 討論
        5.5 結論
    第六章 MC1R敲除兔的生產與新毛色形成機制的初探
        前言
        6.1 試驗材料及儀器設備
            6.1.1 組織材料、菌株和載體
            6.1.2 試驗試劑
            6.1.3 儀器設備
            6.1.4 主要溶液的配制
        6.2 試驗方法
            6.2.1 體外轉錄制備Cas9 m RNA及 sg RNA
            6.2.2 母兔的超排處理與胚胎收集
            6.2.3 受精卵的胞質注射
            6.2.4 胚胎移植與妊娠
            6.2.5 F0代仔兔基因型的檢測
            6.2.6 陽性敲除兔MC1R蛋白結構預測
            6.2.7 陽性兔的脫靶檢測
            6.2.8 PCR產物的純化
            6.2.9 皮膚組織石蠟切片制作及H&E染色觀察
            6.2.10 皮膚組織RNA的提取
            6.2.11 RNA反轉錄合成c DNA
            6.2.12 實時熒光定量PCR檢測相關基因表達量
            6.2.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
        6.3 試驗結果
            6.3.1 CRISPR/Cas9 介導的MC1R基因敲除兔的生產
            6.3.2 MC1R敲除兔的基因型及表型鑒定
            6.3.3 陽性敲除兔MC1R蛋白結構預測
            6.3.4 脫靶效應檢測
            6.3.5 MC1R敲除兔新毛色形成機制的初探
        6.4 討論
        6.5 結論
全文結論
參考文獻
附錄
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]馬毛色遺傳機理研究進展[J]. 趙若陽,趙一萍,李蓓,格日樂其木格,張心壯,陶克濤,圖格琴,旭仁其木格,青柏,李超,白東義,芒來.  遺傳. 2018(05)
[2]6品系彩色獺兔Mc1r和agouti基因mRNA表達量與毛色相關性[J]. 楊翠軍,葛劍,陳賽娟,劉亞娟,陳寶江,谷子林.  中國獸醫(yī)學報. 2016(08)
[3]水牛黑色素皮質素1受體基因克隆、生物信息學分析及表達模式研究[J]. 林宇紓,蔣恒潔,楊豐碩,崔奎青,石德順,劉慶友.  中國畜牧獸醫(yī). 2015(10)
[4]不同毛色貴州水牛MC1R、TYR基因SNP研究[J]. 敖啟燕,胡玲玲,羅師紅,趙永超,王振,劉若余.  中國牛業(yè)科學. 2015(04)
[5]哈薩克綿羊MC1R和ASIP基因多態(tài)性及表達量與被毛顏色表型相關性的研究[J]. 李洪濤,曾獻存,張文祥,趙海璇,惠文巧,劉鋼,羅燕,班謙,趙宗勝,賈斌.  畜牧獸醫(yī)學報. 2013(03)
[6]人工鋅指核酸酶介導的基因組定點修飾技術[J]. 肖安,胡瑩瑩,王唯曄,楊志芃,王展翔,黃鵬,佟向軍,張博,林碩.  遺傳. 2011(07)
[7]馬毛色遺傳的分子基礎與應用[J]. 李蓓,何小龍,趙一萍,王曉靜,芒來,張焱如.  遺傳. 2010(11)

博士論文
[1]應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對哺乳動物GDF8基因編輯的初步研究[D]. 粟小平.廣西大學 2018

碩士論文
[1]TYR、ASIP基因多態(tài)性與綿羊毛色相關的研究[D]. 孟浩浩.石河子大學 2014
[2]10個中國地方綿羊品種MC1R和ASIP基因多態(tài)性及其與毛色關聯(lián)性分析[D]. 付冬麗.甘肅農業(yè)大學 2013



本文編號：3191093