毛色是家畜重要的質(zhì)量性狀之一,與MC1R基因調(diào)控黑色素的合成相關(guān)。家兔作為毛用、皮用和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,其毛皮顏色與其經(jīng)濟(jì)價(jià)值密切相關(guān)。為此,本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),對(duì)敲除家兔MC1R基因獲得新毛色家兔的可行性進(jìn)行了探討,研究主要取得如下結(jié)果:1、兔MC1R基因編碼區(qū)的克隆與分析本研究對(duì)蓮山黑兔、福建黃兔、新西蘭大白兔、巨灰兔和巨型格仔兔的MC1R基因完整CDS區(qū)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增片段與Gen Bank上發(fā)布的兔MC1R的CDS序列一致。隨后對(duì)上述CDS序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析:不同毛色兔MC1R基因的多重序列比對(duì)結(jié)果顯示巨灰兔沒(méi)有缺失突變,等位基因?qū)儆谝吧虴;蓮山黑兔、新西蘭大白兔和巨型格仔兔存在c.281＿286del缺失,等位基因?qū)儆诤谏@性上位型E^D;福建黃兔存在c.304＿333del缺失,等位基因?qū)儆陔[性黃/紅色型e。2、CRSIPR/Cas9介導(dǎo)的MC1R基因敲除效率檢測(cè)本研究根據(jù)蓮山黑兔MC1R基因CDS區(qū)的測(cè)序結(jié)果和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),在第二和第五個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域上設(shè)計(jì)了兩條sg RNA靶序列,成功構(gòu)建了CRISPR/Ca... 

【文章來(lái)源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：157 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞表
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 哺乳動(dòng)物毛色形成機(jī)制
        1.1 黑色素形成過(guò)程
        1.2 影響黑色素生成的分子途徑
        1.3 毛干中的黑色素生成
        1.4 角質(zhì)形成細(xì)胞與黑色素的轉(zhuǎn)運(yùn)
        1.5 黑色素生成中的分子調(diào)控
            1.5.1 α-MSH的調(diào)控
            1.5.2 MITF的調(diào)控
            1.5.3 Wnt信號(hào)通路的調(diào)控
            1.5.4 PKC家族的調(diào)控
            1.5.5 EDN信號(hào)通路的調(diào)控
            1.5.6 SOX家族的調(diào)控
            1.5.7 PAX3的調(diào)控
        1.6 黑色素調(diào)控基因的變異與動(dòng)物毛色決定
            1.6.1 MC1R和 ASIP基因
            1.6.2 KIT基因
            1.6.3 TYRP1基因
            1.6.4 MITF基因
            1.6.5 EDNRB基因
        1.7 小結(jié)與展望
    第二章 MC1R基因的研究進(jìn)展
        2.1 MC1R的結(jié)構(gòu)
        2.2 MC1R活性調(diào)節(jié)
        2.3 MC1R下游信號(hào)通路與第二信使CAMP
            2.3.1 MC1R與色素沉積
            2.3.2 MC1R的紫外線保護(hù)作用
        2.4 MC1R的激素信號(hào)調(diào)節(jié)
        2.5 MC1R基因的多態(tài)性與動(dòng)物毛色形成
            2.5.1 牛
            2.5.2 豬
            2.5.3 犬科動(dòng)物
            2.5.4 馬
            2.5.5 羊
            2.5.6 兔
        2.6 小結(jié)與展望
    第三章 CRISPR基因編輯系統(tǒng)的研究進(jìn)展
        3.1 基因編輯系統(tǒng)的發(fā)展歷程
            3.1.1 第一代基因編輯系統(tǒng):ZFN
            3.1.2 第二代基因編輯系統(tǒng):TALEN
            3.1.3 第三代基因編輯系統(tǒng):CRISPR
        3.2 CRISPR基因編輯系統(tǒng)在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用
            3.2.1 基因敲除
            3.2.2 基因敲入
            3.2.3 單堿基基因編輯
            3.2.4 染色體缺失、重排和核型工程
            3.2.5 基因驅(qū)動(dòng)
            3.2.6 抑制靶基因表達(dá)
            3.2.7 激活靶基因表達(dá)
            3.2.8 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)成像、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)定位跟蹤
            3.2.9 RNA的基因編輯
            3.2.10 質(zhì)粒的克隆和誘變
        3.3 CRISPR基因編輯系統(tǒng)在畜牧業(yè)中的應(yīng)用
            3.3.1 提高家畜經(jīng)濟(jì)性狀
            3.3.2 提高家畜繁殖力和抗病性
            3.3.3 提高畜產(chǎn)品質(zhì)量
            3.3.4 提高動(dòng)物福利
        3.4 CRISPR/CAS9 基因編輯系統(tǒng)在家兔中的應(yīng)用
        3.5 本研究的目的與意義
第二部分 試驗(yàn)研究
    第四章 兔MC1R基因編碼區(qū)的克隆與分析
        前言
        4.1 試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備
            4.1.1 組織材料、菌株和載體
            4.1.2 試驗(yàn)試劑
            4.1.3 儀器設(shè)備
            4.1.4 主要培養(yǎng)基和溶液的配制
        4.2 試驗(yàn)方法
            4.2.1 基因組DNA的提取
            4.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成
            4.2.3 目的基因編碼序列的擴(kuò)增
            4.2.4 目的產(chǎn)物的回收與純化
            4.2.5 目的片段的連接與轉(zhuǎn)化
            4.2.6 質(zhì)粒的提取
            4.2.7 雙酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒
            4.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
        4.3 試驗(yàn)結(jié)果
            4.3.1 不同毛色兔MC1R基因CDS區(qū) PCR擴(kuò)增結(jié)果
            4.3.2 不同毛色兔MC1R基因編碼區(qū)序列測(cè)定結(jié)果
            4.3.3 兔MC1R基因的生物信息學(xué)分析
        4.4 討論
        4.5 結(jié)論
    第五章 CRSIPR/CAS9 介導(dǎo)的MC1R基因敲除效率檢測(cè)
        前言
        5.1 試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備
            5.1.1 試驗(yàn)材料、菌株和載體
            5.1.2 試驗(yàn)試劑
            5.1.3 儀器設(shè)備
            5.1.4 主要培養(yǎng)基和溶液的配制
        5.2 試驗(yàn)方法
            5.2.1 MC1R基因靶序列的設(shè)計(jì)與合成
            5.2.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)相關(guān)載體的構(gòu)建
            5.2.3 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及鑒定
            5.2.4 去內(nèi)毒提取質(zhì)粒
            5.2.5 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)
            5.2.6 Cas9 載體、sg RNA載體和RGS報(bào)告載體共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞
            5.2.7 Cas9 載體和sg RNA載體共轉(zhuǎn)兔胎兒成纖維(RFF)細(xì)胞
            5.2.8 細(xì)胞基因組的提取
            5.2.9 體外轉(zhuǎn)錄模板的制備
            5.2.10 sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄
            5.2.11 Cas9 m RNA的體外轉(zhuǎn)錄
            5.2.12 母兔的超排處理與胚胎收集
            5.2.13 受精卵的胞質(zhì)注射
            5.2.14 PCR擴(kuò)增單個(gè)胚胎目的序列檢測(cè)突變效率
            5.2.15 T7E1酶切檢測(cè)突變效率
            5.2.16 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
        5.3 試驗(yàn)結(jié)果
            5.3.1 兔MC1R基因sg RNA的設(shè)計(jì)及CRISPR/Cas9 相關(guān)表達(dá)載體的構(gòu)建
            5.3.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在293T細(xì)胞上的活性驗(yàn)證
            5.3.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在兔胎兒成纖維細(xì)胞上的活性驗(yàn)證
            5.3.4 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在兔胚胎水平敲除效率的驗(yàn)證
        5.4 討論
        5.5 結(jié)論
    第六章 MC1R敲除兔的生產(chǎn)與新毛色形成機(jī)制的初探
        前言
        6.1 試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備
            6.1.1 組織材料、菌株和載體
            6.1.2 試驗(yàn)試劑
            6.1.3 儀器設(shè)備
            6.1.4 主要溶液的配制
        6.2 試驗(yàn)方法
            6.2.1 體外轉(zhuǎn)錄制備Cas9 m RNA及 sg RNA
            6.2.2 母兔的超排處理與胚胎收集
            6.2.3 受精卵的胞質(zhì)注射
            6.2.4 胚胎移植與妊娠
            6.2.5 F0代仔兔基因型的檢測(cè)
            6.2.6 陽(yáng)性敲除兔MC1R蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
            6.2.7 陽(yáng)性兔的脫靶檢測(cè)
            6.2.8 PCR產(chǎn)物的純化
            6.2.9 皮膚組織石蠟切片制作及H&E染色觀察
            6.2.10 皮膚組織RNA的提取
            6.2.11 RNA反轉(zhuǎn)錄合成c DNA
            6.2.12 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)量
            6.2.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
        6.3 試驗(yàn)結(jié)果
            6.3.1 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的MC1R基因敲除兔的生產(chǎn)
            6.3.2 MC1R敲除兔的基因型及表型鑒定
            6.3.3 陽(yáng)性敲除兔MC1R蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
            6.3.4 脫靶效應(yīng)檢測(cè)
            6.3.5 MC1R敲除兔新毛色形成機(jī)制的初探
        6.4 討論
        6.5 結(jié)論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]馬毛色遺傳機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 趙若陽(yáng),趙一萍,李蓓,格日樂(lè)其木格,張心壯,陶克濤,圖格琴,旭仁其木格,青柏,李超,白東義,芒來(lái).  遺傳. 2018(05)
[2]6品系彩色獺兔Mc1r和agouti基因mRNA表達(dá)量與毛色相關(guān)性[J]. 楊翠軍,葛劍,陳賽娟,劉亞娟,陳寶江,谷子林.  中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(08)
[3]水牛黑色素皮質(zhì)素1受體基因克隆、生物信息學(xué)分析及表達(dá)模式研究[J]. 林宇紓,蔣恒潔,楊豐碩,崔奎青,石德順,劉慶友.  中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2015(10)
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博士論文
[1]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物GDF8基因編輯的初步研究[D]. 粟小平.廣西大學(xué) 2018

碩士論文
[1]TYR、ASIP基因多態(tài)性與綿羊毛色相關(guān)的研究[D]. 孟浩浩.石河子大學(xué) 2014
[2]10個(gè)中國(guó)地方綿羊品種MC1R和ASIP基因多態(tài)性及其與毛色關(guān)聯(lián)性分析[D]. 付冬麗.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3191093