鎘（Cadmium,Cd）是一種高毒性的重金屬元素,對植物的生長發(fā)育具有嚴重的危害作用。自然環(huán)境中的Cd含量通常很低,然而,隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展,礦產(chǎn)開采冶煉和含Cd磷肥的使用等人類活動的擴張,均導(dǎo)致了土壤中重金屬Cd污染的增加。水稻是人們重要的糧食作物之一,其品質(zhì)安全對人們的身體健康至關(guān)重要。在水稻的生長過程中,Cd可以從Cd污染的土壤中被吸收進入根部和地上部分,嚴重影響其代謝、品質(zhì)和安全。因此,減輕土壤中過量的Cd對水稻以及其他作物生長發(fā)育的毒害是科技工作者們研究的重要課題。ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette,簡稱ABC）蛋白是一類多樣性的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白家族,廣泛存在于從細菌到人類的各種生物體中。ABC轉(zhuǎn)運蛋白主要通過水解ATP產(chǎn)生能量,完成底物的轉(zhuǎn)運,包括激素、脂類、無機酸、谷胱甘肽復(fù)合物、多肽和重金屬等。有研究報道,ABC轉(zhuǎn)運蛋白在植物的Cd解毒過程中發(fā)揮著重要的作用。ABCG轉(zhuǎn)運蛋白屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的G亞家族。目前為止,關(guān)于水稻ABCG轉(zhuǎn)運蛋白參與Cd解毒的研究還比較少。本研究主要通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)來構(gòu)建水稻G型ABC轉(zhuǎn)運蛋白基... 

【文章來源】：廣西大學廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 重金屬污染的現(xiàn)狀分析
    1.2 重金屬對植物的損傷
        1.2.1 重金屬對植物生長發(fā)育的影響
        1.2.2 重金屬對植物膜透性的損傷
        1.2.3 重金屬對植物細胞超微結(jié)構(gòu)及光合作用的影響
        1.2.4 重金屬對植物體內(nèi)抗性酶活性的損傷
    1.3 植物對重金屬的排斥機制
    1.4 植物對重金屬的耐受機制
        1.4.1 植物修復(fù)
        1.4.2 植物螯合素與谷胱甘肽
        1.4.3 金屬硫蛋白
        1.4.4 抗氧化酶的防御機制
        1.4.5 激素與重金屬的關(guān)系
    1.5 轉(zhuǎn)運蛋白與重金屬的關(guān)系
        1.5.1 重金屬ATPase
        1.5.2 陽離子擴散促進子蛋白
        1.5.3 鋅/鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運蛋白家族
        1.5.4 NRAMP家族
        1.5.5 銅離子轉(zhuǎn)運蛋白
        1.5.6 YSL蛋白家族
        1.5.7 ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族
            1.5.7.1 ABC轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)與分類
            1.5.7.2 植物體ABC轉(zhuǎn)運蛋白與重金屬的相關(guān)研究
            1.5.7.3 ABCG亞族
    1.6 重金屬Cd的毒害
        1.6.1 鎘的理化性質(zhì)
        1.6.2 植物體內(nèi)鎘的吸收與代謝
        1.6.3 ABC轉(zhuǎn)運蛋白與鎘的相關(guān)研究
        1.6.4 鎘對水稻的毒害及相關(guān)研究
    1.7 研究背景及意義
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
    2.2 本研究主要使用的儀器設(shè)備
    2.3 本研究使用的引物序列
    2.4 各溶液配制
    2.5 本研究中各培養(yǎng)基配制
        2.5.1 LB培養(yǎng)基制備
        2.5.2 酵母SD-ura培養(yǎng)基制備
        2.5.3 酵母SD-metal培養(yǎng)基制備
        2.5.4 酵母YPD培養(yǎng)基制備
        2.5.5 酵母培養(yǎng)基中氨基酸混合物制備
        2.5.6 1/2 MS培養(yǎng)基制備
        2.5.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中的各培養(yǎng)基配制
    2.6 DNA分子操作技術(shù)
        2.6.1 植物基因組總DNA提取
        2.6.2 小量質(zhì)粒DNA的提取
        2.6.3 大量質(zhì)粒DNA的提取
        2.6.4 植物RNA的提取及c DNA的合成
        2.6.5 熒光定量PCR的進行
        2.6.6 PCR反應(yīng)
        2.6.7 DNA的純化
        2.6.8 瓊脂糖凝膠電泳
        2.6.9 酶切和連接反應(yīng)
    2.7 化學轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備
    2.8 大腸桿菌的化學轉(zhuǎn)化及陽性克隆的驗證
    2.9 OsABCG36 表達水平分析中的樣品處理
    2.10 抗體免疫染色實驗
    2.11 水稻原生質(zhì)體的分離及轉(zhuǎn)化
        2.11.1 制備水稻原生質(zhì)體的各種溶液配制
        2.11.2 黃化苗培養(yǎng)
        2.11.3 水稻原生質(zhì)體分離過程
        2.11.4 水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實驗
    2.12 酵母菌相關(guān)實驗
        2.12.1 酵母感受態(tài)細胞制備
        2.12.2 酵母細胞的轉(zhuǎn)化實驗
        2.12.3 OsABCG36 在酵母細胞中的轉(zhuǎn)運活性分析
        2.12.4 酵母細胞鎘排出實驗
        2.12.5 OsABCG36 在酵母細胞中的定位分析
    2.13 OsABCG36 突變體植株構(gòu)建的相關(guān)實驗
        2.13.1 pCRISPR-OsABCG36 敲除載體的構(gòu)建
        2.13.2 農(nóng)桿菌電擊感受態(tài)細胞的制備
        2.13.3 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的電擊轉(zhuǎn)化
        2.13.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的野生型日本晴水稻的遺傳轉(zhuǎn)化
    2.14 植株實驗
        2.14.1 植株相對根長分析
        2.14.2 突變體植株短期鎘處理表型分析
        2.14.3 突變體根中總鎘含量分析
        2.14.4 突變體根細胞液中鎘含量測定
        2.14.5 突變體植株長期鎘處理元素含量分析
        2.14.6 植物木質(zhì)部液中鎘含量分析
    2.15 其他相關(guān)實驗方法
        2.15.1 本研究所用抗生素濃度
        2.15.2 菌株的活化
        2.15.3 菌株的培養(yǎng)與保存
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 OsABCG36 基因生物信息學分析
        3.1.1 OsABCG36 基因基本特征
        3.1.2 OsABCG36 蛋白的結(jié)構(gòu)域分析
        3.1.3 OsABCG36 的同源性分析
    3.2 OsABCG36 的表達模式分析
        3.2.1 OsABCG36 在不同組織中的表達水平分析
        3.2.2 Cd處理后OsABCG36 表達水平分析
        3.2.3 水稻中OsABCG36 同源基因表達水平分析
    3.3 OsABCG36 的組織定位分析
        3.3.1 POsABCG36-GFP融合表達載體的構(gòu)建及植株轉(zhuǎn)化
        3.3.2 抗體免疫染色實驗
    3.4 OsABCG36 蛋白的亞細胞定位分析
        3.4.1 GFP-OsABCG36 融合蛋白表達載體的構(gòu)建
        3.4.2 GFP-OsABCG36 與細胞膜標記蛋白的共定位分析
        3.4.3 GFP-OsABCG36 與液泡膜標記蛋白的共定位分析
    3.5 OsABCG36 在酵母細胞中的功能分析
        3.5.1 OsABCG36 酵母表達載體構(gòu)建
        3.5.2 OsABCG36 在酵母中Cd轉(zhuǎn)運活性分析
        3.5.3 OsABCG36 在酵母中Zn轉(zhuǎn)運活性分析
        3.5.4 酵母中OsABCG36 的定位分析
    3.6 OsABCG36 純合突變體的構(gòu)建及鑒定
        3.6.1 OsABCG36 純合突變體植株的構(gòu)建
        3.6.2 OsABCG36 純合突變體植株的鑒定
    3.7 OsABCG36 突變體植株的短期金屬處理表型分析
        3.7.1 OsABCG36 突變體植株的不同金屬耐受性分析
        3.7.2 OsABCG36 突變體植株短期鎘處理表型
    3.8 根中總鎘和細胞液中鎘含量分析
    3.9 長期鎘處理元素含量測定分析
    3.10 植株木質(zhì)部汁液中鎘含量分析
第四章 討論
    4.1 OsABCG36 參與了鎘的外排
    4.2 OsABCG36與AtABCG36 的功能比較
    4.3 OsABCG36 在水稻解鎘毒中的作用機制
第五章 結(jié)論與展望
參考文獻
致謝
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【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3189388