本文關(guān)鍵詞：miRNAs對(duì)斷奶仔豬大腸桿菌抗性的調(diào)控作用及機(jī)制分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：斷奶仔豬腹瀉和水腫病是導(dǎo)致斷奶仔豬死亡的重要傳染性疾病,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,E.coli F18菌株是引起這兩種疾病的主要病原菌。由于中國(guó)地方豬種抗E. coliF18分子機(jī)制尚不清楚,本研究從microRNA及其靶基因的調(diào)控作用入手,首先基于課題組前期在蘇太豬(具有太湖豬和杜洛克血統(tǒng)的培育品種)F18大腸桿菌抗性型和敏感型個(gè)體microRNA測(cè)序篩選出的重要的]microRNA-miR-192,利用靶基因預(yù)測(cè)、qPCR、雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)、細(xì)胞水平的細(xì)菌感染刺激、TALEN敲除以及microRNA前體SNP檢測(cè)等一系列基因功能驗(yàn)證技術(shù),系統(tǒng)分析miR-192及其靶基因的作用,以期進(jìn)一步揭示microRNAs在斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性的調(diào)控機(jī)制。主要試驗(yàn)結(jié)果如下：(1)一種高效準(zhǔn)確的大腸桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞黏附水平的檢測(cè)方法有助于大腸桿菌抗性相關(guān)miRNA及其靶基因的功能研究,本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,以大腸桿菌F18ab、F18ac和K88ac菌毛蛋白基因和豬β-ACTIN基因設(shè)計(jì)定量PCR引物,以大腸桿菌和豬腸上皮細(xì)胞系(IPEC-J2)總DNA為模板進(jìn)行相對(duì)定量PCR檢測(cè),利用2-△△Ct計(jì)算不同細(xì)胞培養(yǎng)面積孔板中細(xì)菌相對(duì)細(xì)胞黏附數(shù)量。結(jié)果顯示,6孔板、12孔板和24孔板培養(yǎng)面積的豬腸上皮細(xì)胞分別對(duì)F18ab、F18ac口K88ac大腸桿菌的相對(duì)黏附數(shù)量均差異不顯著,大腸桿菌相對(duì)黏附數(shù)量不受細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)量的影響,結(jié)果表明所建立的方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)大腸桿菌相對(duì)黏附數(shù)量,為本研究中大腸桿菌黏附相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供了便捷可靠的檢測(cè)方法。(2)miR-192靶基因的生物信息分析結(jié)合前期表達(dá)譜芯片結(jié)果,獲得5個(gè)重要的靶基因,分別是DLG5、ALCAM、FRMD4B、MIPOL1和ZFHX3,結(jié)合基因生物學(xué)功能和文獻(xiàn)挖掘的結(jié)果,將ALCAM和DLG5基因確定為關(guān)鍵靶基因進(jìn)行相關(guān)功能研究。通過(guò)構(gòu)建關(guān)鍵靶基因非編碼區(qū)的熒光素酶報(bào)告重組載體,與miRNA模擬物(mimics)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,在細(xì)胞水平分析驗(yàn)證miR-192對(duì)于關(guān)鍵靶基因的靶向作用,熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-192 mimics對(duì)ALCAM和DLG5基因均表現(xiàn)為抑制作用(P0.05)。(3)關(guān)鍵靶基因ALCAM和DLG5的表達(dá)譜分析結(jié)果表明,DLG5基因在蘇太豬35日齡斷奶仔豬抗性型和敏感型個(gè)體的空腸、十二指腸、肝臟、肺、腎等組織中高度表達(dá),抗性型個(gè)體的相對(duì)表達(dá)量高于敏感型個(gè)體,且在心臟和淋巴組織中達(dá)到顯著水平(P0.05),在所有組織中抗性型和敏感型個(gè)體表達(dá)水平的差異倍數(shù)為1,04%6,464；ALCAM基因在蘇太豬的肝臟、肺、腎組織中高度表達(dá),在胃、淋巴、十二指腸和空腸組織中度表達(dá),在其他組織中表達(dá)量相對(duì)較低,且抗性型和敏感型個(gè)體各組織組間差異均不顯著。在蘇太豬從初生到斷奶不同發(fā)育時(shí)期(8日齡、18日齡、28目齡和35日齡)的表達(dá)差異分析結(jié)果表明,DLG5基因在肌肉、肺臟及免疫(胸腺、淋巴和脾臟)等組織中隨日齡增加表達(dá)降低,十二指腸和空腸組織中在28日齡的表達(dá)量降至最低,35日齡時(shí)呈上升趨勢(shì)。ALCAM基因28日齡腎臟組織中表達(dá)量顯著高于8日齡(P0.05)；28日齡和35日齡十二指腸組織的表達(dá)量顯著低于18日齡,呈下調(diào)趨勢(shì)(P0.05)。(4)在豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2中分析F18ab、F18ac和K88ac侵襲對(duì)miR-192及其關(guān)鍵靶基因表達(dá)的影響,細(xì)菌刺激未對(duì)miR-192的轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生顯著影響,細(xì)菌培養(yǎng)上清刺激也沒(méi)有引起miR-192轉(zhuǎn)錄水平的顯著變化,且不隨刺激時(shí)間表現(xiàn)出變化趨勢(shì)；細(xì)菌刺激引起了DLG5和ALCAM基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)(P0.05),細(xì)菌培養(yǎng)上清刺激也能引起DLG5和ALCAM基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),且隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),DLG5和ALCAM基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)呈顯著下調(diào)趨勢(shì)(P0.05)。(5)利用TALEN載體介導(dǎo)敲除IPEC-J2細(xì)胞miR-192成熟體,獲得miR-192成熟體序列缺失的細(xì)胞株,對(duì)細(xì)胞株中重要靶基因表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果表明,miR-192敲除細(xì)胞和對(duì)照組的DLG5、ALCAM, FRMD4B的表達(dá)水平差異不顯著,而MIPOL1和ZFHX3在敲除細(xì)胞中的表達(dá)水平表現(xiàn)為顯著下調(diào)(P0.05),大腸桿菌黏附水平檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-192敲除細(xì)胞對(duì)大腸桿菌F18ab、F18ac和K88ac的黏附能力均表現(xiàn)為顯著上升(P0.05)。鑒于蘇太豬同時(shí)具有外來(lái)品種和中國(guó)地方豬品種的遺傳基礎(chǔ),關(guān)于蘇太豬microRNAs的研究并不能完全代表和揭示中國(guó)地方豬品種斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性的調(diào)控機(jī)制。因此,本研究又以中國(guó)地方豬品種梅山豬為研究對(duì)象,利用E. coli F18菌株對(duì)梅山斷奶仔豬進(jìn)行大腸桿菌感染試驗(yàn),并通過(guò)細(xì)菌數(shù)量檢測(cè)、小腸上皮細(xì)胞體外黏附及病理檢測(cè)等一系列試驗(yàn)對(duì)大腸桿菌感染試驗(yàn)的表型結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)的驗(yàn)證,獲得了確證的E.coli F18抗性型和敏感型個(gè)體,然后利用Selex高通量測(cè)序,篩選梅山豬斷奶仔豬抗性型和敏感型個(gè)體間差異microRNAs,通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)、網(wǎng)絡(luò)互作圖構(gòu)建等生物信息學(xué)手段,結(jié)合課題組前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,篩選出重要的靶基因及其調(diào)控通路,同時(shí)利用RNAi技術(shù)和細(xì)菌感染在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證重要靶基因及其通路基因?qū)Υ竽c桿菌感染的調(diào)控作用,探討中國(guó)地方斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性相關(guān)的microRNA分子及其關(guān)鍵靶基因的功能及其調(diào)控機(jī)制。主要試驗(yàn)結(jié)果如下：(1)對(duì)蘇太豬中發(fā)揮重要調(diào)控作用的miR-192在梅山豬中進(jìn)行初步的功能分析驗(yàn)證,組織表達(dá)譜結(jié)果顯示,miR-192在十二指腸和空腸組織中均具有較高水平的表達(dá),肝和腎中度表達(dá),在心、脾、肺、胃、肌肉、胸腺和淋巴中表達(dá)量較低。結(jié)合前期梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌試驗(yàn)的結(jié)果,大腸桿菌處理沒(méi)有造成十二指腸和空腸組織中miR-192表達(dá)水平的顯著性變化,miR-192可能并沒(méi)有在梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌感染過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。(2)利用前期通過(guò)大腸桿菌感染試驗(yàn)和一系列驗(yàn)證獲得的確證的梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌抗性型和敏感型全同胞個(gè)體,對(duì)其十二指腸組織進(jìn)行microRNA高通量測(cè)序分析,獲得梅山豬抗性型和敏感型全同胞個(gè)體差異miRNAs 24個(gè),其中上調(diào)15個(gè),下調(diào)9個(gè)；通過(guò)qPCR方法檢測(cè)驗(yàn)證miRNAs的差異倍數(shù),發(fā)現(xiàn)其與高通量篩選結(jié)果具有較高的一致性；結(jié)合課題組前期梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌抗性型和敏感型全同胞個(gè)體的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果以及差異miRNAs的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果,并通過(guò)靶基因互作網(wǎng)絡(luò)的分析,將miR-7136-5p及其靶基因MyD88基因確定為關(guān)鍵microRNA和關(guān)鍵靶基因,鑒于MyD88是TLRs/IL-1R信號(hào)通路中重要的接頭蛋白,將其所在TLR4信號(hào)通路作為本試驗(yàn)重點(diǎn)研究的關(guān)鍵調(diào)控通路,分析其在大腸桿菌感染中的作用及其機(jī)制。(3)F18ac和K88ac菌體刺激后,豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2的MyD88轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào),其所在的TLR4通路中TNFa基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào)(P0.01)。細(xì)菌培養(yǎng)液上清刺激后,MyD88基因在8小時(shí)后急劇下調(diào),：TNFa基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P0.05)。受大腸桿菌F18ac和K88ac刺激后,PK15細(xì)胞的MyD88同樣顯著下調(diào)(P0.05); F18ac使TLR4通路中CD14基因的表達(dá)極顯著上調(diào)(P0.01),而K88ac的刺激未顯著改變其表達(dá);IFN-a表達(dá)變化不顯著,K88ac刺激使TLR4通路中IL-1β和TLR4基因輕度上調(diào),jTNF-a基因水平極顯著上調(diào)(P0.01)。細(xì)菌培養(yǎng)上清液同樣使PK15細(xì)胞MyD88基因整體表現(xiàn)下調(diào)；CD14基因整體為下調(diào)；IFN-a表現(xiàn)為下調(diào)；IL-1β和TLR4基因整體趨勢(shì)為上調(diào)；F18ac上清處理組TNF-a表現(xiàn)為極顯著水平的上調(diào)(P0.01),而K88ac上清處理組TNF-a未表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)。(4)利用RNAi技術(shù)獲得干擾豬MyD88基因效率最高的shRNA表達(dá)載體,將其包裝成慢病毒載體,用于建立MyD88基因穩(wěn)定沉默的細(xì)胞系,最終獲得MyD88基因的干擾效率分別為69.3%、61.0%的IPEC-J2和PK15細(xì)胞。MyD88基因的下調(diào)造成PK15細(xì)胞TLR4和1L-1β基因表達(dá)水平顯著下調(diào)(P0.05),而CD14、IFN-a和TNF-a基因表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化。RNAi MyD88基因未對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中細(xì)胞因子IL-1β和TNF-a的水平造成顯著影響。(5)MyD88基因穩(wěn)定沉默的PK15細(xì)胞系受大腸桿菌F18ac和K88ac刺激后,MyD88基因仍表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá),并且干擾組PK15細(xì)胞的TLR4和IL-1β基因變化趨勢(shì)大于對(duì)照組；CD14基因變化趨勢(shì)小于對(duì)照組,TNF-a基因變化趨勢(shì)與對(duì)照組相似,IFN-a表現(xiàn)出了顯著下調(diào)的變化(P0.05)。受大腸桿菌培養(yǎng)上清刺激后,干擾組PK15細(xì)胞的TLR4、CD14、 MyD88、IL-1β、IFN-a變化趨勢(shì)與對(duì)照組相似,而干擾組PK15的TNF-a變化趨勢(shì)小于對(duì)照組。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子IL-1β和TNF-a檢測(cè)結(jié)果顯示,大腸桿菌F18ac和K88ac菌體刺激均使IL-1β水平極顯著增高(P0.01),且干擾組上調(diào)趨勢(shì)大于對(duì)照組；K88ac培養(yǎng)上清液刺激使IL-1β顯著增高(P0.05),且干擾組和對(duì)照組趨勢(shì)相似。F18ac和K88ac菌體和培養(yǎng)上清液刺激均未對(duì)干擾組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-a水平產(chǎn)生顯著影響。本研究結(jié)果表明,microRNA在蘇太豬和梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌感染過(guò)程中均發(fā)揮了重要的調(diào)控作用,而且進(jìn)一步提示梅山豬(中國(guó)地方豬品種)和蘇太豬(含有外來(lái)豬品種血統(tǒng)的培育品種)在大腸桿菌病抗性的遺傳基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制方面確實(shí)存在差異。miR-192靶向作用DLG5和ALCAM基因在蘇太豬斷奶仔豬應(yīng)對(duì)大腸桿菌侵襲、維持腸道穩(wěn)定、免疫調(diào)控等方面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用, miR-7136-5p靶向作用MyD88基因進(jìn)而影響TLR4通路在梅山豬斷奶仔豬應(yīng)對(duì)大腸桿菌侵襲和免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：豬 miRNAs 靶基因 調(diào)控機(jī)制 大腸桿菌
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.28
【目錄】：

• 摘要7-11
• ABSTRACT11-16
• 符號(hào)說(shuō)明16-18
• 主要儀器設(shè)備18-19
• 主要數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)址19-20
• 第一章 綜述20-27
• 1 仔豬腹瀉與E.coli F18致病機(jī)理20-21
• 2 E.coli F18抗性相關(guān)的分子研究21-22
• 3 microRNA及其調(diào)控作用22-24
• 4 基因修飾技術(shù)24-25
• 5 本研究的目的和意義25-27
• 第二章 miRNA192及其靶基因?qū)μK太斷奶仔豬大腸桿菌抗性的作用分析27-70
• 第一節(jié) 基于定量PCR技術(shù)檢測(cè)大腸桿菌黏附水平方法的建立27-34
• 1 材料方法27-29
• 1.1 材料27-28
• 1.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增28
• 1.3 實(shí)時(shí)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定28
• 1.4 大腸桿菌黏附腸上皮細(xì)胞及DNA提取28-29
• 1.5 數(shù)據(jù)分析29
• 2 結(jié)果與分析29-32
• 2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定29-30
• 2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線30
• 2.3 定量檢測(cè)細(xì)菌相對(duì)黏附及數(shù)據(jù)分析30-32
• 3 討論32-34
• 第二節(jié) miRNA192靶基因預(yù)測(cè)及其關(guān)鍵靶基因的靶向驗(yàn)證34-45
• 1 材料與方法34-36
• 1.1 試驗(yàn)材料34
• 1.2 miR-192在不同物種中的保守性分析34
• 1.3 miR-192靶基因預(yù)測(cè)及功能分析34-35
• 1.4 E.coli F18大腸桿菌抗性相關(guān)的靶基因篩選及功能分析35
• 1.5 靶基因3'-UTR靶點(diǎn)區(qū)域的oligos序列合成35
• 1.6 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建35-36
• 1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染36
• 1.8 雙熒光素酶活性檢測(cè)36
• 2 結(jié)果與分析36-42
• 2.1 miR-192保守性36-37
• 2.2 豬miR-192靶基因預(yù)測(cè)及功能37-40
• 2.3 E.coli F18大腸桿菌感染相關(guān)的靶基因篩選40
• 2.4 ALCAM和DLG5基因3'-UTR雙熒光素酶報(bào)告載體40-41
• 2.5 熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)41-42
• 3 討論42-45
• 第三節(jié) 關(guān)鍵靶基因(DLG5、ALCAM)的差異表達(dá)分析45-52
• 1 材料與方法45-47
• 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物45-46
• 1.2 試劑46
• 1.3 熒光定量引物設(shè)計(jì)與合成46
• 1.4 總RNA抽提及Real-time PCR反應(yīng)46
• 1.5 數(shù)據(jù)分析46-47
• 2 結(jié)果47-49
• 2.1 熒光定量引物PCR驗(yàn)證情況47
• 2.2 DLG5和ALCAM基因在蘇太豬大腸桿菌抗性敏感群體間的表達(dá)47-48
• 2.3 DLG5和ALCAM基因在蘇太豬不同日齡個(gè)體中的表達(dá)48-49
• 3 討論49-52
• 第四節(jié) 大腸桿菌侵染對(duì)miR-192及其關(guān)鍵靶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響52-56
• 1 材料與方法52-53
• 1.1 試驗(yàn)材料52
• 1.2 大腸桿菌及培養(yǎng)上清液侵染IPEC-J2細(xì)胞52-53
• 1.3 miR-192反轉(zhuǎn)錄和定量檢測(cè)53
• 1.4 靶基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)53
• 2 結(jié)果與分析53-54
• 2.1 大腸桿菌侵染對(duì)IPEC-J2細(xì)胞中miR-192的影響53-54
• 2.2 關(guān)鍵靶基因表達(dá)54
• 3 討論54-56
• 第五節(jié) miRNA192敲除及其功能驗(yàn)證56-70
• 1 材料和方法56-60
• 1.1 材料56
• 1.2 TALEN識(shí)別序列設(shè)計(jì)56-57
• 1.3 TALEN左右臂載體組裝連接及鑒定57-58
• 1.4 嘌呤霉素最小致死濃度58
• 1.5 TALEN左右臂質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞58
• 1.6 嘌呤霉素篩選及鑒定58
• 1.7 單克隆細(xì)胞株挑選及鑒定58
• 1.8 陽(yáng)性單克隆細(xì)胞miR-192的表達(dá)鑒定58-59
• 1.9 miR-192宿主基因及靶基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)59-60
• 1.10 大腸桿菌黏附水平驗(yàn)證60
• 2 結(jié)果與分析60-68
• 2.1 酶切鑒定結(jié)果60
• 2.2 測(cè)序比對(duì)結(jié)果60-63
• 2.3 轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞及靶點(diǎn)區(qū)域片段擴(kuò)增及測(cè)序63-64
• 2.4 單克隆細(xì)胞株miR-192打靶情況的鑒定及分析64-66
• 2.5 miR-192表達(dá)水平的檢測(cè)66-67
• 2.6 miR-192宿主基因擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄水平67
• 2.7 miR-192靶基因在敲除細(xì)胞中表達(dá)水平67-68
• 2.8 miR-192敲除對(duì)IPEC-J2細(xì)胞黏附大腸桿菌能力的影響68
• 3 討論68-70
• 第三章 梅山斷奶仔豬大腸桿菌抗性相關(guān)microRNAs篩選及其功能分析70-109
• 第一節(jié) miRNA192在梅山豬中表達(dá)分析70-73
• 1 材料與方法70-71
• 1.1 材料70
• 1.2 miR-192探針合成70
• 1.3 總RNA抽提及反轉(zhuǎn)錄70-71
• 1.4 組織表達(dá)譜分析71
• 2 結(jié)果與分析71-72
• 2.1 miR-192的組織表達(dá)譜檢測(cè)71-72
• 2.2 攻毒組與對(duì)照組個(gè)體十二指腸和空腸中miR-192的表達(dá)72
• 3 討論72-73
• 第二節(jié) 梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌抗性型和敏感型全同胞個(gè)體差異microRNAs的篩選73-87
• 1 材料與方法73-76
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣本采集73
• 1.2 試劑材料73
• 1.3 小RNA文庫(kù)建立及高通量測(cè)序73-74
• 1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制和預(yù)處理分析74
• 1.5 序列比對(duì)及分類注釋74
• 1.6 比對(duì)統(tǒng)計(jì)74-75
• 1.7 堿基偏好性統(tǒng)計(jì)分析75
• 1.8 Novel miRNAs預(yù)測(cè)75
• 1.9 miRNA差異表達(dá)分析75
• 1.10 差異miRNA功能分析75
• 1.11 靶基因GO功能分析75-76
• 1.12 靶基因KEGG pathway分析76
• 1.13 差異miRNAs的QPCR驗(yàn)證76
• 2 結(jié)果與分析76-85
• 2.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)76-77
• 2.2 染色體分布77-78
• 2.3 small RNA序列分類統(tǒng)計(jì)78-79
• 2.4 堿基偏好性統(tǒng)計(jì)79-80
• 2.5 小RNA在抗性敏感型個(gè)體中分布80
• 2.6 差異miRNA篩選80-82
• 2.7 差異miRNA靶基因功能富集分析82-84
• 2.8 差異miRNAs定量PCR驗(yàn)證84
• 2.9 關(guān)鍵靶基因分析和確定84-85
• 3 討論85-87
• 第三節(jié) 大腸桿菌侵染對(duì)細(xì)胞中TLR4通路相關(guān)基因的影響87-92
• 1 材料方法87-88
• 2 結(jié)果與分析88-90
• 3 討論90-92
• 第四節(jié) MyD88基因沉默及其對(duì)所在TLR4通路基因表達(dá)水平的影響92-102
• 1 材料與方法92-95
• 1.1 材料92
• 1.2 引物設(shè)計(jì)及序列合成92-93
• 1.3 干擾載體構(gòu)建93
• 1.4 表達(dá)載體構(gòu)建93-94
• 1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及干擾效率驗(yàn)證94
• 1.6 慢病毒載體包裝及滴度測(cè)定94-95
• 1.7 病毒液感染豬IPEC-J2和PK15細(xì)胞95
• 1.8 定量檢測(cè)MyD88基因沉默PK15細(xì)胞中TLR4通路相關(guān)基因表達(dá)95
• 1.9 細(xì)胞培養(yǎng)上清炎性因子檢測(cè)95
• 2 結(jié)果分析95-100
• 2.1 載體構(gòu)建95-96
• 2.2 干擾效率驗(yàn)證96-97
• 2.3 慢病毒液滴度測(cè)定97
• 2.4 干擾病毒顆粒對(duì)IPEC-J2和PK15細(xì)胞MyD88的干擾效率97-99
• 2.5 MyD88基因沉默對(duì)TLR4通路相關(guān)基因表達(dá)的影響99
• 2.6 MyD88基因沉默對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中免疫因子水平影響99-100
• 3 討論100-102
• 第五節(jié) 大腸桿菌侵襲對(duì)MyD88基因沉默PK15細(xì)胞的效應(yīng)分析102-109
• 1 材料與方法102
• 2 結(jié)果與分析102-107
• 3 討論107-109
• 全文結(jié)論109-110
• 創(chuàng)新之處110-111
• 參考文獻(xiàn)111-121
• 致謝121-123
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文123-124

【相似文獻(xiàn)】

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李紫薇;蒺藜苜蓿E2F/DP基因鑒定及鹽脅迫表達(dá)分析[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

2 栗振義;紫花苜蓿熱激蛋白基因MsHSP70的克隆及功能分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

3 陳凱麗;綿羊SPLUNC1基因的克隆、表達(dá)及活性檢測(cè)[D];石河子大學(xué);2015年

4 翟曼君;雞與鵪鶉屬間雜交種胚胎早期死亡相關(guān)基因的功能研究[D];石河子大學(xué);2015年

5 任曉宇;飛蝗CYP4和CYP303A1基因的分子特性和功能研究[D];山西大學(xué);2014年

6 劉恒生;豬LMNA基因?qū)τ诩∪夂椭景l(fā)育及分化的調(diào)控研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

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9 張偉;轉(zhuǎn)錄組篩選調(diào)控脂肪儲(chǔ)存基因[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

10 孔曄;馬鈴薯甲蟲(chóng)4個(gè)細(xì)胞色素P450氧化酶基因的分子克隆及功能驗(yàn)證[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：miRNAs對(duì)斷奶仔豬大腸桿菌抗性的調(diào)控作用及機(jī)制分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：316919