牦牛作為青藏高原上的特有物種,對農(nóng)牧民具有重要的經(jīng)濟價值,但其因為自然繁殖率低,體外受精（IVF）無疑成為解決這一問題的主要手段。然而,牦牛卵母細胞的質(zhì)量是成功受精以及影響胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因素。黃曲霉素B₁（AFB₁）作為飼料中最危險的霉菌毒素,對飼料的污染無法完全避免,且污染后高度穩(wěn)定。誤食因AFB₁污染的飼料會導(dǎo)致哺乳動物的生殖毒性,破壞卵母細胞表觀遺傳修飾和質(zhì)量,并影響受精。因此,預(yù)防和緩解因AFB₁誘導(dǎo)的毒性最有效的方法是補充藥物或抗氧化劑�？箟难幔ˋA）作為一種抗氧化劑被廣泛的應(yīng)用于細胞培養(yǎng),并且已被證實是DNA甲基化調(diào)節(jié)中TET雙加氧酶不可替代的輔助因子。然而,AA對牦牛IVF胚胎DNA甲基化調(diào)控的作用以及是否能夠保護牦牛卵母細胞免受AFB₁的毒性影響仍然未知。本實驗通過DNA甲基化評估了AA對牦牛植入前胚胎的發(fā)育影響,以及AA對暴露在AFB₁中卵母細胞的保護作用,旨在闡明其可能發(fā)生的具體機制。1.添加不同濃度的AA培養(yǎng)IVF胚胎,統(tǒng)計卵裂率和... 

【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
SUMMARY
英文縮寫詞表Ⅰ
英文縮寫詞表Ⅱ
第一部分 文獻綜述
    第一章 哺乳動物的DNA甲基化
        1 DNA甲基化的建立與維持
        2 DNA去甲基化
            2.1 被動去甲基化機制
            2.2 主動去甲基化機制
        3 哺乳動物基因組中5mC的分布
        4 哺乳動物基因組中5hmC的分布
        5 胚胎的DNA甲基化
        6 卵母細胞的DNA甲基化
            6.1 卵母細胞甲基化分布
            6.2 卵母細胞甲基化功能
        7 DNA甲基化對基因組的作用
            7.1 甲基化對印記基因和X染色體失活的作用
            7.2 甲基化對轉(zhuǎn)座子的作用
            7.3 甲基化對特異性基因表達的作用
        8 小結(jié)
    第二章 抗壞血酸對DNA甲基化的影響
2+和2OG">        1 TET雙加氧酶與Fe²⁺和2OG
        2 AA是TET雙加氧酶的輔助因子
        3 AA對DNA去甲基化的作用
        4 AA對產(chǎn)后發(fā)育的影響
        5 AA的有效性變化
        6 小結(jié)
    第三章 黃曲霉素B1對DNA甲基化的影響
        1 化學(xué)環(huán)境與DNA甲基化
1與DNA甲基化">        2 黃曲霉素B₁與DNA甲基化
        3 胚胎中ROS的產(chǎn)生
            3.1 外源性因素導(dǎo)致的ROS
        4 活性氧對胚胎的損傷
        5 活性氧的防御系統(tǒng)
            5.1 非酶物質(zhì)與ROS
            5.2 酶促防御
            5.3 氧化應(yīng)激的修復(fù)
        6 體外胚胎技術(shù)與ROS
            6.1 氣體環(huán)境
            6.2 共培養(yǎng)環(huán)境
            6.3 溫度環(huán)境
            6.4 培養(yǎng)基中的抗氧化物
            6.5 金屬螯合物
            6.6 巰基化合物
            6.7 蛋白質(zhì)類
            6.8 維他命
        7 小結(jié)
第二部分 實驗研究
    第一章 不同濃度AA對牦牛IVF胚胎發(fā)育的影響
        1 材料與試劑
            1.1 實驗樣品
            1.2 主要儀器
            1.3 主要耗材
            1.4 主要試劑
        2 試驗方法
            2.1 收集牦牛卵母細胞和成熟培養(yǎng)
            2.2 牦牛卵母細胞的體外受精和胚胎培養(yǎng)
            2.3 囊胚細胞的凋亡染色與計數(shù)
            2.4 囊胚微量RNA的提取
            2.5 反轉(zhuǎn)錄（cDNA）
            2.6 Real Time PCR引物設(shè)計與合成
            2.7 Real Time PCR
            2.8 統(tǒng)計學(xué)分析
        3 結(jié)果
            3.1 不同濃度AA對胚胎發(fā)育的影響
            3.2 不同濃度AA對囊胚階段凋亡基因表達的影響
            3.3 不同濃度的AA對囊胚細胞凋亡的影響
        4 討論
        5 小結(jié)
1暴露引起的DNA甲基化異常">    第二章 抗壞血酸保護牦牛卵母細胞免受黃曲霉素B₁暴露引起的DNA甲基化異常
        1 材料與試劑
            1.1 實驗樣品
            1.2 主要儀器
            1.3 主要耗材
            1.4 主要試劑
        2 試驗方法
            2.1 收集牦牛卵母細胞和成熟培養(yǎng)
            2.2 AFB1的暴露和AA的添加
            2.3 卵母細胞孤雌激活發(fā)育能力的評估
            2.4 精卵結(jié)合能力的評估
            2.5 氧化應(yīng)激檢測
            2.6 凋亡檢測
            2.7 線粒體分布評估
            2.8 肌動蛋白動力學(xué)評估
            2.9 卵母細胞的微量RNA提取
            2.10 反轉(zhuǎn)錄（cDNA）
            2.11 Real Time PCR引物設(shè)計與合成
            2.12 Real Time PCR
            2.13 卵母細胞的甲基化染色
            2.14 圖像分析法
            2.15 統(tǒng)計學(xué)分析
        3 結(jié)果
1中卵母細胞的減數(shù)分裂成熟">            3.1 AA改善了暴露在AFB₁中卵母細胞的減數(shù)分裂成熟
1中卵母細胞的孤雌發(fā)育能力">            3.2 AA改善了暴露在AFB₁中卵母細胞的孤雌發(fā)育能力
1中卵母細胞與精子的結(jié)合能力">            3.3 AA提高了暴露在AFB₁中卵母細胞與精子的結(jié)合能力
1 中卵母細胞的ROS水平">            3.4 AA降低了暴露在AFB₁ 中卵母細胞的ROS水平
1中卵母細胞的早期凋亡">            3.5 AA抑制了暴露在AFB₁中卵母細胞的早期凋亡
1中卵母細胞的線粒體分布狀態(tài)">            3.6 AA改善了暴露在AFB₁中卵母細胞的線粒體分布狀態(tài)
1中卵母細胞的肌動蛋白">            3.7 AA恢復(fù)了暴露在AFB₁中卵母細胞的肌動蛋白
1 中卵母細胞的DNA甲基化水平">            3.8 AA改善了暴露在AFB₁ 中卵母細胞的DNA甲基化水平
        4 討論
        5 小結(jié)
    第三章 AA對牦牛IVF胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化的影響
        1 材料與試劑
            1.1 實驗樣品
            1.2 主要儀器
            1.3 主要耗材
            1.4 主要試劑
        2 試驗方法
            2.1 收集牦牛卵母細胞和成熟培養(yǎng)
            2.2 牦牛卵母細胞體外受精和體外培養(yǎng)
            2.3 囊胚微量RNA的提取
            2.4 反轉(zhuǎn)錄（cDNA）
            2.5 Real Time PCR引物設(shè)計與合成
            2.6 Real Time PCR
            2.7 胚胎的甲基化免疫熒光染色
                2.7.1 對不同濃度下各階段胚胎進行5mC和5hmC的免疫熒光染色分析,具體步驟:
                2.7.2 對不同濃度下各階段胚胎進行TET3的免疫熒光染色分析,具體步驟
            2.8 圖像分析法
            2.9 統(tǒng)計學(xué)分析
        3 結(jié)果
            3.1 AA對植入前胚胎DNA甲基化基因表達的影響
            3.2 AA對植入前胚胎5mC/5hmC動態(tài)表達的影響
            3.3 AA對植入前胚胎TET3基因表達的影響
            3.4 AA對植入前胚胎TET3動態(tài)表達的影響
        4 討論
        5 小結(jié)
    第四章 AA對牦牛IVF囊胚階段多能性基因啟動子區(qū)域的甲基化影響
        1 材料與試劑
            1.1 實驗樣品
            1.2 主要儀器
            1.3 主要耗材
            1.4 主要試劑
        2 試驗方法
            2.1 收集牦牛卵母細胞和成熟培養(yǎng)
            2.2 牦牛卵母細胞體外受精和體外培養(yǎng)
            2.3 囊胚微量RNA的提取
            2.4 反轉(zhuǎn)錄（cDNA）
            2.5 Real Time PCR引物設(shè)計與合成
            2.6 Real Time PCR
            2.7 多能性基因啟動子區(qū)域的甲基化檢測
            2.8 統(tǒng)計學(xué)分析
        3 結(jié)果
            3.1 AA對囊胚階段多能性基因表達的影響
            3.2 AA對囊胚階段多能性基因啟動子區(qū)域甲基化水平的影響
        4 討論
        5 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻
致謝
作者簡介
在讀期間發(fā)表論文和研究成果等
導(dǎo)師簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Global hypomethylation in hepatocellular carcinoma and its relationship to aflatoxin B1 exposure[J]. Hulya Yazici,Ming-Whei Yu,Po-Huang Lee,Regina M Santella.  World Journal of Hepatology. 2012(05)



本文編號：3155095