種子是種質(zhì)資源保存的重要載體,對延續(xù)物種起著重要作用,但種子自成熟后,會發(fā)生活力逐漸下降的不可逆過程,我們稱之為種子老化。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)種子老化過程中存在活性氧（reactive oxygen species,ROS）介導的線粒體途徑的細胞程序化死亡（Programmed cell death,PCD）,但具體機制尚不清楚。有文獻表明線粒體外膜電壓依賴性陰離子通道蛋白（voltage-dependent anionchannel,VDAC）是線粒體途徑的PCD中不可缺少的元件,對細胞死亡進程的引發(fā)起關(guān)鍵作用。本研究以家榆（Ulmus pumila L.）種子為實驗材料,對VDAC在種子老化過程中的作用及其機制開展研究。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.家榆種子老化過程中,伴隨ROS爆發(fā),線粒體形態(tài)功能均發(fā)生變化。ROS供體和抑制劑預(yù)處理種子活力檢測結(jié)果表明,ROS的積累與種子活力的降低之間具有緊密的聯(lián)系。線粒體特異性熒光探針標記檢測發(fā)現(xiàn)線粒體在衰老早期的聚集與ROS的產(chǎn)生有關(guān)。利用蛋白雙向電泳對老化過程中家榆種子線粒體蛋白組進行分析,質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)有37種蛋白,伴隨著ROS的爆發(fā)和線粒體... 

【文章來源】：北京林業(yè)大學北京市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：146 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要縮略詞
引言
1 文獻綜述
    1.1 種子老化概述
        1.1.1 種子老化劣變
        1.1.2 種子老化與PCD的關(guān)系
    1.2 線粒體介導的細胞死亡
        1.2.1 種子老化過程線粒體的變化
        1.2.2 線粒體途徑的PCD
        1.2.3 線粒體外膜通道蛋白VDAC
    1.3 ROS與種子老化關(guān)系概述
        1.3.1 ROS介導的PCD
        1.3.2 蛋白氧化修飾
    1.4 GAPDH與細胞死亡
        1.4.1 GAPDH功能多樣性
        1.4.2 GAPDH氧化修飾與細胞凋亡
    1.5 金屬與氧化
        1.5.1 金屬催化的蛋白氧化
        1.5.2 金屬脅迫促進GSH合成
    1.6 立題依據(jù)與技術(shù)路線
2 種子老化過程中ROS引發(fā)的線粒體形態(tài)及功能變化
    2.1 材料方法
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與載體
        2.1.3 種子老化及發(fā)芽實驗
        2.1.4 藥理學處理
2O₂含量測定">        2.1.5 H₂O₂含量測定
        2.1.6 ROS及線粒體分布的觀察
        2.1.7 線粒體呼吸速率檢測
        2.1.8 線粒體純度檢測
        2.1.9 SDS-PAGE凝膠電泳
        2.1.10 蛋白雙向電泳
        2.1.11 羰基化檢測
        2.1.12 western blotting
        2.1.13 MDH基因片段獲得
        2.1.14 原核表達載體構(gòu)建
        2.1.15 重組蛋白誘導表達及純化
        2.1.16 MDH酶活測定及離體線粒體NADH攝取速率測定
        2.1.17 統(tǒng)計分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 家榆種子老化過程中ROS水平與種子活力的關(guān)系
        2.2.2 ROS對線粒體形態(tài)與分布的影響
        2.2.3 老化過程線粒體蛋白差異表達分析
        2.2.4 響應(yīng)ROS的線粒體蛋白豐度變化分析
        2.2.5 TCA循環(huán)蛋白下調(diào)導致線粒體呼吸速率降低
        2.2.6 VDAC上調(diào)伴隨線粒體Cytc釋放
        2.2.7 線粒體蛋白的羰基化修飾
        2.2.8 羰基化修飾影響蛋白功能
    2.3 討論
        2.3.1 ROS引起種子老化過程中線粒體分布和形態(tài)的改變
        2.3.2 線粒體抗氧化酶的下調(diào)可能導致種子老化過程中ROS爆發(fā)
        2.3.3 ROS可能通過破壞TCA循環(huán)和ETC影響線粒體呼吸作用
        2.3.4 VDAC可能參與了種子老化過程中線粒體途徑的PCD
        2.3.5 羰基化修飾可能影響了老化后期的能量及蛋白質(zhì)代謝
    2.4 小結(jié)
3 谷胱甘肽化修飾介導的GAPDH與VDAC互作參與VDAC通道功能調(diào)控
    3.1 材料方法
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株與載體
        3.1.3 表達載體構(gòu)建
        3.1.4 重組蛋白誘導表達純化及UpGAPDH1體外谷胱甘肽化
        3.1.5 atgapc1和atvdac3突變體及過表達擬南芥篩選鑒定
        3.1.6 GST pull-down
        3.1.7 蛋白雙向電泳及質(zhì)譜測序
        3.1.8 免疫共沉淀
        3.1.9 離體線粒體KC1處理
        3.1.10 原生質(zhì)體游離
        3.1.11 免疫熒光
        3.1.12 Dot blotting
        3.1.13 石蠟切片
        3.1.14 TUNEL
        3.1.15 Duolink PLA
        3.1.16 金屬含量測定
        3.1.17 谷胱甘肽含量測定
        3.1.18 UpGAPDH1氨基酸定點突變
        3.1.19 統(tǒng)計分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 VDAC在種子老化中的作用
        3.2.2 種子老化過程中UpVDAC3互作蛋白篩選
        3.2.3 種子老化過程中GAPDH與VDAC的互作分析
        3.2.4 谷胱甘肽化介導的GAPDH與VDAC互作
        3.2.5 種子老化過程中GAPDH的谷胱甘肽化水平
        3.2.6 GAPDH谷胱甘肽化修飾加速線粒體Cyt c釋放及細胞死亡
        3.2.7 種子老化早期GSH含量升高
        3.2.8 Zn促進GSH水平升高
        3.2.9 Zn或GSH促進種子老化依賴VDAC
        3.2.10 Zn和GSH促進線粒體Cytc釋放及細胞死亡
        3.2.11 金屬離子促進ROS爆發(fā)
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
4 金屬介導的羰基化修飾參與VDAC功能調(diào)控
    4.1 材料方法
        4.1.1 試驗材料
        4.1.2 菌株與載體
        4.1.3 UpVDAC3氨基酸定點突變
        4.1.4 重組蛋白誘導表達純化
        4.1.5 植物表達載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
        4.1.6 點突變UpVDAC3亞細胞定位分析
        4.1.7 過表達擬南芥獲得及篩選
        4.1.8 IMAC金屬親和層析
        4.1.9 pYES2-UpVDAC3載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和表達
        4.1.10 酵母DNA提取
        4.1.11 重組融合蛋白檢測
        4.1.12 Western-blotting
        4.1.13 UpVDAC3重組蛋白金屬處理及羰基化檢測
        4.1.14 酵母氧化處理實驗
        4.1.15 統(tǒng)計分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 金屬結(jié)合蛋白可能是種子老化過程羰基化修飾的靶點
        4.2.2 VDAC序列分析及氨基酸定點突變
        4.2.3 點突變VDAC金屬結(jié)合能力及羰基化修飾敏感性分析
        4.2.4 點突變UpVDAC3亞細胞定位分析
        4.2.5 VDAC羰基化對酵母細胞的影響
        4.2.6 UpVDAC3羰基化修飾在擬南芥種子老化中的作用
        4.2.7 谷胱甘肽化的UpGAPDH1增加UpVDAC3對羰基化修飾的敏感性
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
5 結(jié)論
6 討論
7 展望
參考文獻
附錄A 引物表
附錄B 家榆種子老化過程中差異表達的線粒體蛋白依照分子功能分類表
附錄C 具有Binding功能的差異表達線粒體蛋白詳細分類表
附錄D 金屬結(jié)合蛋白所能結(jié)合金屬種類預(yù)測表
2+-IMAC捕獲金屬結(jié)合蛋白列表">附錄E Cu²⁺-IMAC捕獲金屬結(jié)合蛋白列表
2+-IMAC捕獲金屬結(jié)合蛋白列表">附錄F Zn²⁺-IMAC捕獲金屬結(jié)合蛋白列表
2+-IMAC捕獲金屬結(jié)合蛋白列表">附錄G Fe²⁺-IMAC捕獲金屬結(jié)合蛋白列表
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【參考文獻】：
期刊論文
[1]Feed supplementation with arginine and zinc on antioxidant status and inflammatory response in challenged weanling piglets[J]. Nadia Bergeron,Claude Robert,Frédéric Guay.  Animal Nutrition. 2017(03)
[2]Early stage toxicity of excess copper to photosystem II of Chlorella pyrenoidosa–OJIP chlorophyll a fluorescence analysis[J]. XIA Jianrong1, TIAN Qiran2 1. School of Environmental Science and Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China.2. Marine Biology Institute, Shantou University, Shantou, Guangdong 515063, China.  Journal of Environmental Sciences. 2009(11)
[3]高溫加速老化過程中甜菜種子線粒體小分子量熱激蛋白22的變化（英文）[J]. 宋松泉,KennethM.Fredlund,IanM.Mller.  植物生理學報. 2001(01)
[4]人工老化過程紅松種胚細胞物質(zhì)外滲和超微結(jié)構(gòu)變化[J]. 趙墾田,李立華.  東北林業(yè)大學學報. 2000(03)



本文編號：3155231