發(fā)布時(shí)間：2021-04-11 18:24

　　牙鲆（Paralichthys olivaceus）屬于鰈形目牙鲆科,是我國非常重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一,其典型的胚后變態(tài)發(fā)育是研究不對稱發(fā)育機(jī)制的良好模型。牙鲆變態(tài)發(fā)育的主要特征是外部形態(tài)上由左右兩側(cè)對稱的眼睛發(fā)生移位到左側(cè),并且生活方式由浮游性變?yōu)榉仔�。在這個(gè)過程中各組織也發(fā)生了重構(gòu),其結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生了變化,這些變化被認(rèn)為是由于基因的組織特異性表達(dá)所致。業(yè)已表明,這些基因的組織特異性表達(dá)是直接或間接受甲狀腺激素的誘導(dǎo),用外源甲狀腺激素處理變態(tài)前的牙鲆會導(dǎo)致變態(tài)提前發(fā)生,而用甲狀腺激素抑制劑硫脲處理則可以使變態(tài)停滯。在牙鲆變態(tài)發(fā)育過程中除了甲狀腺激素誘導(dǎo)外,micro RNA也發(fā)揮著重要的作用。Micro RNA是一類由22個(gè)左右的堿基組成的非編碼小分子RNA,通常在翻譯水平負(fù)調(diào)控靶基因m RNA的表達(dá)。Micro RNA是基因組編碼的內(nèi)源性小分子RNA,需要經(jīng)過加工才能成為成熟的有功能的Micro RNA。動物mi RNA的加工成熟通常需要Drosha和Dicer兩個(gè)RNaseⅢ酶的參與。其中Drosha酶主要負(fù)責(zé)在細(xì)胞核內(nèi)將mi RNA前前體pri-mi RNA切割成前體pr... 

【文章來源】：上海海洋大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：117 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
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縮略詞表
第一章 引言
    1.1 牙鲆變態(tài)的分子機(jī)制
    1.2 甲狀腺激素在牙鲆變態(tài)發(fā)育過程中的作用
    1.3 Drosha基因在個(gè)體發(fā)育中的作用
第二章 甲狀腺激素對牙鲆Drosha基因表達(dá)的影響
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
        2.1.1 樣品采集
        2.1.2 主要試劑與儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 牙鲆組織總RNA提取與鑒定
        2.2.2 cDNA第一鏈的合成
        2.2.3 引物設(shè)計(jì)
        2.2.4 牙鲆Drosha基因片段克隆
        2.2.5 牙鲆Drosha基因全長克隆
        2.2.6 Drosha基因cDNA小片段、5'RACE和 3'RACE序列拼接
        2.2.7 生物信息學(xué)分析
        2.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 牙鲆Drosha cDNA克隆及分析
        2.3.2 .Drosha基因在牙鲆發(fā)育過程中的表達(dá)分析
    2.4 討論
        2.4.1 Drosha基因在各組織中的表達(dá)
        2.4.2.Drosha基因仔魚各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)
        2.4.3 外源甲狀腺激素對Drosha基因表達(dá)的影響
第三章 甲狀腺激素受體與DROSHA蛋白的相互作用
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
    3.2 結(jié)果
    3.3 討論
        3.3.1 利用免疫共沉淀技術(shù)研究THR-Drosha之間的相互作用
        3.3.2 實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制
        3.3.3 THR和Drosha相互作用調(diào)控miRNA的生成
第四章RNA干擾沉默Drosha基因表達(dá)
    4.1 材料
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 Drosha-siRNA靶點(diǎn)的選擇、設(shè)計(jì)及合成
        4.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        4.2.3 轉(zhuǎn)染效率的檢測
        4.2.4 Realtime-PCR檢測Drosha mRNA表達(dá)
        4.2.5 Western blot檢測Drosha蛋白表達(dá)
        4.2.6 siRNA最佳作用濃度的篩選
        4.2.7 siRNA最佳作用時(shí)間的篩選
        4.2.8 細(xì)胞凋亡檢測
        4.2.9 Realtime-PCR檢測Drosha下游基因CDKN2A,Cdc42 的表達(dá)
        4.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 siRNA轉(zhuǎn)染效果檢測
        4.3.2 siRNA沉默效果檢測
        4.3.3 siRNA最佳濃度的篩選
        4.3.4 siRNA最佳作用時(shí)間的篩選
        4.3.5 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡的檢測
        4.3.6 Realtime-PCR檢測Drosha基因沉默后pri-miRNA和miRNA的表達(dá)
        4.3.7 Realtime-PCR檢 測Drosha基 因沉默后細(xì)胞周期調(diào)控基因CDKN2A,Cdc42 mRNA表達(dá)
    4.4 討論
        4.4.1 利用siRNA干擾技術(shù)靶向抑制Drosha基因的表達(dá)
        4.4.2 牙鲆胚胎細(xì)胞中Drosha基因靶向沉默對下游基因的影響
        4.4.3 靶向沉默Drosha基因后導(dǎo)致miRNA表達(dá)譜的變化
第五章microRNA靶基因預(yù)測及驗(yàn)證
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 肌肉相關(guān)microRNA靶基因預(yù)測及驗(yàn)證
        5.2.2 細(xì)胞周期相關(guān)靶基因預(yù)測及驗(yàn)證
    5.3 討論
        5.3.1 α-TM在牙鲆組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)
        5.3.2 牙鲆HDAC4 序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        5.3.3 牙鲆HDAC4 在牙鲆發(fā)育過程中的作用
        5.3.4 牙鲆HDAC4 是miR-1 和miR-133a的靶基因
        5.3.5 牙鲆Cdc42 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及在牙鲆發(fā)育過程中的作用
        5.3.6 Cdc42 是miR-17 的靶基因
第六章 總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]牙鲆中Dicer基因的鑒定與表達(dá)[J]. 王古樾,付元帥,施志儀,張俊玲.  海洋漁業(yè). 2013(03)
[2]文昌魚tropomyosin基因的克隆、進(jìn)化分析及其胚胎發(fā)育與成體中的表達(dá)模式[J]. 李忻怡,林浴霜,張紅衛(wèi).  動物學(xué)研究. 2012(04)
[3]外源甲狀腺素及可的松對牙鲆早期發(fā)育階段生長、發(fā)育和變態(tài)的影響[J]. 鮑寶龍,張臻宇,龔小玲,王秀紅.  上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào). 1999(03)

博士論文
[1]牙鲆變態(tài)過程中microRNA的表達(dá)及其功能分析[D]. 付元帥.上海海洋大學(xué) 2011



本文編號：3131736