本文關(guān)鍵詞：藏豬腸道細(xì)菌群落組成與纖維素分解菌的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：養(yǎng)豬業(yè)是我國(guó)耗糧性最大的畜牧業(yè),研究我國(guó)一些優(yōu)良地方豬種耐粗飼的生物學(xué)特性,對(duì)于培育節(jié)糧型新豬種,發(fā)展節(jié)糧性養(yǎng)豬業(yè)具有重要意義。藏豬是生長(zhǎng)在我國(guó)青藏高原,可以終年放牧,以草為主進(jìn)行飼養(yǎng)的地方特色品種,其食草性、抗寒性、抗病性、芳香性、環(huán)保性等優(yōu)良特性備受?chē)?guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。藏豬的食草特性必然與其腸道獨(dú)特的微生物密切相關(guān)。為了揭示藏豬的食草特性,本研究對(duì)藏豬胃腸道的細(xì)菌群落組成與多樣性、纖維素分解菌的分離篩選、纖維素酶的酶學(xué)特性、纖維素酶的生產(chǎn)、纖維素酶基因的克隆以及纖維素分解菌的益生評(píng)定等方面進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究,結(jié)果如下:1、采用DGGE方法研究藏豬胃腸道中的細(xì)菌群落組成及多樣性,發(fā)現(xiàn)藏豬盲腸中細(xì)菌的種類(lèi)最為豐富,其次為胃、回腸、空腸和十二指腸。藏豬胃腸道中的細(xì)菌分別屬于Bacteroidetes、Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Spirochaetes,其中61%屬于新種,并且不同的腸段其優(yōu)勢(shì)菌不同。通過(guò)對(duì)藏豬和瘦肉型豬盲腸中的細(xì)菌群落組成及多樣性分析,發(fā)現(xiàn)藏豬盲腸中的細(xì)菌更具有多樣性,不同個(gè)體間盲腸中的細(xì)菌群落組成的相似性達(dá)到80%以上,而瘦肉型豬則為65%。藏豬DGGE圖譜中的特異性DNA條帶以及DNA的豐度也均高于瘦肉型豬。Bacteroidetes和Firmicutes均為兩個(gè)豬種的優(yōu)勢(shì)菌門(mén),但Bacteroidetes的豐富度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Firmicutes。此外,在兩個(gè)豬種的盲腸中均發(fā)現(xiàn)了多種與纖維降解相關(guān)的細(xì)菌,如Prevotella、Ruminiclostridium、Anaerovibrio、Sphaerochaeta,Bacteroides、Parabacteroides,但藏豬盲腸中的纖維素分解菌比瘦肉型豬高11.2%。2、采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)研究?jī)蓚�(gè)豬種盲腸中的細(xì)菌群落組成及多樣性,發(fā)現(xiàn)從藏豬和瘦肉型豬盲腸樣品中得到的去雜優(yōu)化后的細(xì)菌16S rRNA基因V4-V5區(qū)序列數(shù)分別為75,069條和74,759條,平均長(zhǎng)度為393.8 bp;按照序列97%相似性進(jìn)行OTU聚類(lèi)分析,發(fā)現(xiàn)藏豬和瘦肉型豬分別得到660個(gè)OTU和668個(gè)OTU。兩個(gè)豬種盲腸中的細(xì)菌群落組成相似,其中藏豬盲腸中的細(xì)菌分為15個(gè)門(mén),70個(gè)屬,而瘦肉型豬分為15門(mén)和74個(gè)屬,但藏豬盲腸中具有穩(wěn)定的細(xì)菌群落,在不同個(gè)體間有256個(gè)OTU是共享的,共享的核心菌群占腸道細(xì)菌序列總數(shù)的88.10%,分為7個(gè)門(mén),而瘦肉型豬盲腸中的核心菌群占細(xì)菌序列總數(shù)的81.29%,分為6個(gè)門(mén)。Bacteroidetes和Firmicutes均為兩個(gè)豬種盲腸中最豐富的細(xì)菌類(lèi)群,并且Bacteroidetes的豐度均高于Firmicutes。但與瘦肉型豬相比,藏豬不僅具有高豐度的Bacteroidetes和低豐度的Firmicutes,而且盲腸中有42.4%的細(xì)菌屬于unclassified和uncultured細(xì)菌類(lèi)群,與腸道疾病緊密相關(guān)的Proteobacteria也極顯著低于瘦肉型豬(P0.01)。在兩個(gè)豬種的盲腸中均發(fā)現(xiàn)了更多的與降解纖維素有關(guān)的細(xì)菌如Ruminococcus、Bacteroides、Prevotella、Clostridium、Butyricicoccus、Fibrobacte、Lachnospira、Anaerovibrio、Parabacteroides等。由此可見(jiàn),藏豬長(zhǎng)期食草的特性不僅與腸道微生物群落的穩(wěn)定性、復(fù)雜性及大量不可培養(yǎng)和未分類(lèi)的微生物有關(guān),還可能與長(zhǎng)期采食青粗飼料形成的特殊消化生理有關(guān)。3、采用羧甲基纖維素鈉平板法和搖瓶發(fā)酵法從藏豬盲腸內(nèi)容物中分離篩選到了一株能夠高效降解纖維素的細(xì)菌,通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rRNA分子學(xué)方法將其鑒定為枯草芽孢桿菌,命名為Baclitis sublitis BY-2。Bacillus sublitis BY-2生長(zhǎng)快,在接種后8-20 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期,20-36 h為穩(wěn)定期,36 h后繁殖逐漸進(jìn)入衰退期。Bacillus sublitis BY-2所產(chǎn)纖維素酶最適反應(yīng)條件為pH5.5、65℃,反應(yīng)5 min,且該纖維素酶具有強(qiáng)的酸堿耐受性和熱穩(wěn)定性。此外,Bacillus sublitis BY-2發(fā)酵所需的最佳碳源為1%玉米粉,最佳氮源為2%的蛋白胨+酵母粉復(fù)合物(1:1),在發(fā)酵起始pH為5.5,接種量4%,發(fā)酵至24-36 h時(shí)產(chǎn)酶量高且穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)酶學(xué)反應(yīng)和產(chǎn)酶條件的優(yōu)化,Bacillus sublitis BY-2在發(fā)酵至24 h時(shí)的酶活(3.43 U/mL)比其原始酶活(0.40 U/mL)提高了近8.6倍。4、從Bacillus subtilis BY-2基因組DNA中克隆到了纖維素酶基因egls-BY,其長(zhǎng)度為1500 bp,能夠連續(xù)編碼499個(gè)氨基酸。序列分析表明,纖維素酶基因egls-BY所編碼的纖維素酶屬于糖苷水解酶家族5,并且包含一個(gè)CMB-3的結(jié)構(gòu)域,該基因在大腸桿菌中得到了表達(dá),其蛋白分子量在55 kDa左右,表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在細(xì)胞體內(nèi)。5、體外益生模擬試驗(yàn)表明,Bacillus sublitis BY-2具有強(qiáng)的抗逆特性。在65-85℃的條件下保存20 min,其存活率在89.83-91.07%之間;在pH1-4的人工胃液中培養(yǎng)4 h時(shí),BY-2存活率仍達(dá)73.78-83.61%;用人工胃液處理2 h,然后用人工腸液以及不同膽鹽濃度的人工腸液中繼續(xù)處理4 h,Bacillus sublitis BY-2的存活率仍達(dá)75%以上。Bacillus sublitis BY-2能夠分泌具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物,對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用,并且對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞ZYM-SIEC02的毒性小;此外,Bacillus sublitis BY-2對(duì)ZYM-SIEC02粘附性小,但對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞ZYM-SIEC02的粘附有一定的粘附抑制作用。因此,對(duì)于具有生長(zhǎng)快,產(chǎn)酶早、產(chǎn)酶能力高且穩(wěn)定的、且具有強(qiáng)抗逆特性的纖維素分解菌Bacillus subtilis BY-2,不僅對(duì)于揭示藏豬食草特性具有重要意義,而且可為產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)提供必要的試驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：藏豬 細(xì)菌群落組成及多樣性 纖維素分解菌 纖維素酶 益生菌
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 上篇 文獻(xiàn)綜述15-36
• 第一章 豬腸道微生物群落與纖維素分解菌的研究進(jìn)展及意義15-36
• 1.1 引言15-16
• 1.2 豬腸道微生物的組成及變化16-17
• 1.3 影響腸道微生物的因素17-24
• 1.3.1 品種與年齡17-18
• 1.3.2 日糧纖維18-19
• 1.3.3 抗生素19
• 1.3.4 微生態(tài)制劑19-22
• 1.3.5 其他物質(zhì)22-24
• 1.4 分子生物技術(shù)在胃腸道微生物研究中的應(yīng)用24-27
• 1.4.1 16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)24-25
• 1.4.2 變性梯度凝膠電泳技術(shù)25-26
• 1.4.3 高通量測(cè)序技術(shù)26-27
• 1.5 食草動(dòng)物的食草特性與腸道微生物27-28
• 1.6 纖維素分解菌及纖維素酶的研究進(jìn)展28-32
• 1.6.1 纖維素分解菌的來(lái)源及分離28-29
• 1.6.2 纖維素酶作用機(jī)制及其生產(chǎn)29-30
• 1.6.3 影響纖維素酶飼用效果的因素30-31
• 1.6.4 纖維素酶基因的克隆表達(dá)及基因工程菌的構(gòu)建31-32
• 1.7 益生菌的評(píng)定及發(fā)展趨勢(shì)32-35
• 1.7.1 益生菌的作用機(jī)制及發(fā)展32-34
• 1.7.2 益生菌篩選標(biāo)準(zhǔn)及應(yīng)用34
• 1.7.3 益生菌的發(fā)展趨勢(shì)34-35
• 1.8 研究的目的和意義35
• 1.9 研究的技術(shù)路線35-36
• 下篇 試驗(yàn)研究36-116
• 第二章 藏豬胃腸道不同區(qū)段細(xì)菌群落多樣性及組成研究36-55
• 2.1 引言36
• 2.2 材料與方法36-41
• 2.2.1 樣品的采集36-37
• 2.2.2 質(zhì)粒載體與主要試劑37
• 2.2.3 主要儀器設(shè)備37-38
• 2.2.4 豬胃腸道微生物總DNA的提取38
• 2.2.5 豬胃腸道細(xì)菌 16S rRNA基因V4-V5區(qū)序列的擴(kuò)增38
• 2.2.6 PCR產(chǎn)物的純化回收38
• 2.2.7 試劑配制38-39
• 2.2.8 變性梯度凝膠電泳39-40
• 2.2.9 DGGE圖譜上優(yōu)勢(shì)條帶的切割回收及克隆測(cè)序40-41
• 2.2.10 DGGE圖譜分析及序列分析41
• 2.3 結(jié)果與分析41-52
• 2.3.1 藏豬胃腸道細(xì)菌的多樣性42-44
• 2.3.2 藏豬胃腸道細(xì)菌群落組成分析44-47
• 2.3.3 藏豬和瘦肉型豬盲腸細(xì)菌的多樣性的比較分析47-48
• 2.3.4 藏豬和外來(lái)豬種瘦肉型豬盲腸細(xì)菌群落組成比較分析48-52
• 2.4 討論52-54
• 2.4.1 細(xì)菌 16S rRNA基因可變區(qū)的選擇52
• 2.4.2 藏豬胃腸道細(xì)菌的多樣性及群落組成52-53
• 2.4.3 藏豬和瘦肉型豬盲腸細(xì)菌的多樣性及群落組成比較分析53-54
• 2.5 小結(jié)54-55
• 第三章 藏豬和瘦肉型豬盲腸細(xì)菌群落多樣性及組成研究55-74
• 3.1 引言55
• 3.2 材料和方法55-58
• 3.2.1 樣品準(zhǔn)備55
• 3.2.2 細(xì)菌 16S rRNA V4-V5高變區(qū)擴(kuò)增55-56
• 3.2.4 Miseq文庫(kù)構(gòu)建56
• 3.2.5 Miseq測(cè)序56
• 3.2.6 測(cè)數(shù)據(jù)優(yōu)化與統(tǒng)計(jì)56
• 3.2.7 測(cè)序數(shù)據(jù)的分析56-58
• 3.2.8 生物統(tǒng)計(jì)分析及作圖58
• 3.2.9 核酸序列登錄58
• 3.3 結(jié)果與分析58-71
• 3.3.1 兩個(gè)豬種盲腸微生物總DNA的提取和細(xì)菌 16S rRNA基因V4-V5區(qū)擴(kuò)增58-59
• 3.3.2 藏豬和瘦肉型豬盲腸細(xì)菌的豐富度和多樣性比較分析59-61
• 3.3.3 藏豬和瘦肉型豬盲腸細(xì)菌群落組成的比較分析61-67
• 3.3.4 藏豬和瘦肉型豬盲腸中核心菌群的比較分析67-71
• 3.4 討論71-73
• 3.4.1 藏豬和瘦肉型豬盲腸中細(xì)菌群落的多樣性71
• 3.4.2 藏豬和瘦肉型豬盲腸中的核心菌群71-72
• 3.4.4 藏豬盲腸中細(xì)菌群落組成與食草特性72-73
• 3.5 小結(jié)73-74
• 第四章 藏豬盲腸中纖維素分解菌的分離鑒定及特性研究74-94
• 4.1 引言74
• 4.2 材料與方法74-81
• 4.2.1 材料74-75
• 4.2.2 方法75-81
• 4.2.3 數(shù)據(jù)的整理與分析81
• 4.3 結(jié)果與分析81-91
• 4.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制81-82
• 4.3.2 纖維素分解菌的分離篩選82-83
• 4.3.3 纖維素分解菌的鑒定83-85
• 4.3.4 纖維素分解菌Bacillus sublitis BY-2 的生長(zhǎng)特性85-86
• 4.3.5 CMCase的酶學(xué)特性分析86-88
• 4.3.6 發(fā)酵條件對(duì)Bacillus sublitis BY-2 產(chǎn)CMCase的影響88-91
• 4.4 討論91-93
• 4.4.1 纖維素分解菌的分離與篩選91
• 4.4.2 纖維素分解菌Bacillus subtilis BY-2 的生長(zhǎng)特性91
• 4.4.3 CMCase的酶學(xué)特性91-92
• 4.4.4 發(fā)酵條件對(duì)Bacillus subtilis BY-2 產(chǎn)酶的影響92-93
• 4.5 小結(jié)93-94
• 第五章 藏豬源Bacillus subtilis BY-2 纖維素酶基因的克隆表達(dá)94-104
• 5.1 引言94
• 5.2 材料與方法94-98
• 5.2.1 材料94-95
• 5.2.2 方法95
• 5.2.3 引物設(shè)計(jì)95
• 5.2.4 Bacillus sublitis BY-2 纖維素酶基因的克隆及表達(dá)95-98
• 5.3 結(jié)果與分析98-102
• 5.3.1 Bacillus sublitis BY-2 纖維素酶基因egls-BY的克隆98
• 5.3.2 纖維素酶基因egls-BY的序列分析98-99
• 5.3.3 纖維素酶蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)99-100
• 5.3.4 纖維素酶基因egls-BY的原核表達(dá)100-101
• 5.3.5 纖維素酶基因egls-BY表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析101-102
• 5.4 討論102-103
• 5.4.1 纖維素酶基因的克隆102
• 5.4.2 纖維素酶基因egls-BY的表達(dá)及SDS-PAGE分析102-103
• 5.5 小結(jié)103-104
• 第六章 藏豬源Bacillus sublitis BY-2 的益生特性研究104-116
• 6.1 引言104
• 6.2 材料和方法104-109
• 6.2.1 材料104-105
• 6.2.2 方法105-109
• 6.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析109
• 6.3 結(jié)果與分析109-112
• 6.3.1 Bacillus subtilis BY-2 的耐熱能力109
• 6.3.2 Bacillus subtilis BY-2 耐人工胃液能力109-110
• 6.3.3 Bacillus subtilis BY-2 的耐人工腸液和耐膽鹽能力110-111
• 6.3.4 Bacillus sublitis BY-2 的抑菌特性111
• 6.3.5 Bacillus sublitis BY-2 對(duì)細(xì)胞的毒性和粘附試驗(yàn)111-112
• 6.4 討論112-115
• 6.4.1 Bacillus sublitis BY-2 的耐熱性113
• 6.4.2 Bacillus sublitis BY-2 的耐酸性113
• 6.4.3 Bacillus sublitis BY-2 的耐人工腸液和耐膽鹽性113-114
• 6.4.4 Bacillus sublitis BY-2 的抑菌特性114
• 6.4.5 Bacillus sublitis BY-2 對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞的毒性及粘附特性114-115
• 6.5 小結(jié)115-116
• 結(jié)論116-117
• 創(chuàng)新點(diǎn)117
• 進(jìn)一步研究的問(wèn)題117-118
• 參考文獻(xiàn)118-135
• 附錄135-142
• 縮略詞142-143
• 致謝143-144
• 作者簡(jiǎn)介144

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