本文關鍵詞：家蠶幼蟲絲腺細胞核內有絲分裂的調控因素及相關蛋白的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：家蠶是鱗翅目昆蟲的重要模式生物之一,同時也是重要的泌絲經濟昆蟲。絲腺是家蠶幼蟲特有的泌絲器官。家蠶絲腺細胞只在胚胎期發(fā)生約10次有絲分裂,繼而形成形態(tài)學上和功能學上可劃分的前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺,共形成約1080個細胞。自此直到幼蟲期結束,絲腺細胞不再發(fā)生有絲分裂,只進行DNA復制和細胞體積增大的特殊核內有絲分裂。在幼蟲期,絲腺細胞內基因組含量增加約40萬倍,到五齡時絲腺細胞核幾乎布滿了整個胞質區(qū)域,使得細胞核與細胞質充分接觸,大大增加了核質間的物質交流,為家蠶在吐絲期快速而又大規(guī)模的合成絲蛋白提供了極為有利的條件。隨著家蠶全基因組和轉錄組測序的完成,許多研究學者再次把目光聚焦到家蠶絲蛋白合成的機制上。家蠶絲蛋白合成的前提是其絲腺細胞高效的核內有絲分裂,然而絲腺細胞高效核內有絲分裂的調控機制尚不清楚。家蠶絲腺細胞發(fā)生核內有絲分裂的時間跨度和DNA復制效率在自然界已知的生物中是最特異和高效的,闡明絲腺細胞高效核內有絲分裂的調控機制,可為提高家蠶絲產量和蠶業(yè)發(fā)展提供重要理論依據,也可望為完善細胞周期調控機制提供重要線索。本研究首先對家蠶幼蟲期絲腺細胞核內DNA復制變化的趨勢進行了詳細分析；然后鑒定了蛻皮激素、保幼激素、營養(yǎng)、胰島素對絲腺細胞DNA復制的影響,進一步闡明了影響絲腺細胞核內有絲分裂的生理因素,并探究其調控機制,為解析家蠶幼蟲絲腺細胞核內有絲分裂的調控機制奠定了重要基礎。主要研究結果和結論如下：1.家蠶幼蟲期絲腺細胞核內DNA復制情況通過BrdU標記方法結合組織免疫熒光技術,對家蠶幼蟲期絲腺細胞DNA復制情況進行詳細分析。研究結果發(fā)現,家蠶幼蟲期絲腺細胞DNA復制呈波動趨勢,在剛蛻皮即眠起時有自激發(fā)現象,自此到盛食期被逐漸激發(fā),且在盛食期達到最高,將眠時被逐漸抑制,在眠期達到最低。隨著齡期的推進DNA復制程度越來越高,在五齡三天時DNA復制活性達到最高,且在五齡末期后部絲腺細胞先停止DNA復制,隨后是中部絲腺和前部絲腺細胞。另外,利用熒光定量PCR對細胞周期相關基因在家蠶幼蟲期絲腺中的表達情況進行分析,結果顯示細胞周期相關基因在絲腺中的表達變化與家蠶幼蟲期絲腺細胞DNA復制的波動趨勢基本一致。家蠶幼蟲期絲腺細胞DNA復制的這種變化趨勢,表明絲腺細胞DNA復制與調控家蠶幼蟲發(fā)育的因素相關。因此,我們推測蛻皮激素、保幼激素和營養(yǎng)可能參與調控絲腺細胞核內有絲分裂。2.激素和饑餓對絲腺細胞核內有絲分裂的調控研究我們選擇家蠶四齡幼蟲作為激素和饑餓處理的材料,通過體內注射和體外培養(yǎng)方法結合BrdU標記技術,發(fā)現體內注射蛻皮激素(20E)后絲腺細胞DNA復制被逐漸抑制,體外培養(yǎng)添加20E后絲腺細胞DNA復制沒有變化：無論體內注射還是體外培養(yǎng)處理,保幼激素(JH)對絲腺細胞DNA復制都沒有影響,表明JH不能激發(fā)絲腺細胞DNA復制。以上研究結果表明在家蠶幼蟲體內20E能抑制絲腺細胞DNA復制,說明在家蠶幼蟲將眠和眠期時絲腺細胞DNA復制被逐漸抑制受體內蛻皮激素的調控。饑餓處理后絲腺細胞DNA復制被抑制,重新喂食后又被激發(fā),再饑餓后又被抑制,再次添食桑葉后絲腺細胞DNA復制重新被激發(fā)。饑餓處理后家蠶幼蟲血淋巴中海藻糖和氨基酸的含量發(fā)生了變化。通過注射海藻糖、氨基酸、葡萄糖或三者混合物至饑餓處理后的家蠶幼蟲體內,研究發(fā)現它們都不能重新激發(fā)絲腺細胞DNA復制,表明單一營養(yǎng)因子不能激發(fā)絲腺DNA復制。以上研究結果說明蛻皮間期絲腺細胞DNA復制被激發(fā)與家蠶幼蟲大量進食桑葉有關。3.胰島素信號對絲腺細胞核內有絲分裂的調控研究通過體內注射和體外培養(yǎng)方法結合BrdU標記技術,發(fā)現胰島素能激發(fā)絲腺細胞DNA復制。通過體外培養(yǎng)添加信號通路特異抑制劑處理,發(fā)現PI3K信號通路、TOR信號通路和ERK信號通路都參與絲腺細胞DNA復制的調控。通過體外培養(yǎng)添加胰島素和上述各信號通路抑制劑處理,再結合BrdU標記技術和Western Blot分析,發(fā)現PI3K信號通路和TOR信號通路協(xié)同介導胰島素對家蠶幼蟲絲腺細胞DNA復制的激發(fā),且PI3K信號通路位于TOR信號通路的上游；胰島素不能激發(fā)ERK信號通路,推測其可能受到其他因子的調控。另外,Western Blot分析結果表明體內注射20E處理和饑餓處理都能抑制P13K信號通路和TOR信號通路,說明胰島素信號通路也參與20E和饑餓對家蠶幼蟲絲腺細胞DNA復制的調控。4.定量蛋白組學分析家蠶幼蟲眠期和盛食期絲腺組織差異表達蛋白我們利用iTRAQ標記方法結合質譜技術,鑒定了家蠶幼蟲眠期和盛食期絲腺組織差異表達蛋白,共鑒定到蛋白4170個,差異蛋白181個,盛食期的與眠期的相比,上調蛋白71個,下調蛋白110個。對鑒定到的差異蛋白進行GO分析,發(fā)現分子功能注釋中9個條目和生物學過程中19個條目發(fā)生了改變。將差異蛋白在KEGG數據庫中進行Pathway顯著性富集分析,發(fā)現這些差異蛋白富集到115個不同的生化途徑和信號通路中,說明盛食期的絲腺細胞與眠期的相比其生理生化發(fā)生明顯的改變；此外,37%的差異蛋白富集到脂類、碳水化合物等代謝通路當中,說明能量代謝相關途徑也發(fā)生了明顯的改變。我們進一步篩選了與細胞周期相關的15個信號通路,對富集到其中的差異表達基因進行了驗證和分析,并對發(fā)生最顯著差異的Pathway中差異倍數最大的基因(SilkDB ID:BGIBMGA005826)做了進一步研究。GO分析和KEGG Pathway富集分析顯示,該基因參與脂類代謝,且與癌癥發(fā)生相關。家蠶基因芯片數據分析和熒光定量PCR檢測結果表明,該基因在家蠶五齡三天絲腺組織中特異高表達,并且在家蠶幼蟲絲腺中的表達變化與絲腺細胞DNA復制波動趨勢基本一致,因此,我們猜測該基因可能與絲腺細胞高效核內有絲分裂調控相關。結構域預測顯示,該基因包含一個保守的昆蟲類型的短鏈脫氫酶結構域(ADH_SDR_c_like),屬于經典類型的短鏈脫氫酶超家族,在結構域上含有4個活性位點和19個NAD(P)結合位點,故將其命名為BmADH,推測其與能量代謝通路相關。然后,我們進一步對BmADH基因的功能進行了分析。免疫熒光檢測結果顯示BmADH基因定位于胞質中。在家蠶胚胎細胞系中干涉BmADH基因后能抑制TOR信號通路并抑制DNA復制。熒光定量PCR和免疫印跡檢測結果表明,體內注射20E處理和饑餓處理后絲腺中BmADH基因的mRNA和蛋白表達水平均顯著下調,說明BmADH基因的表達受到蛻皮激素和營養(yǎng)的調控。以上研究結果不僅從側面驗證了20E、饑餓和胰島素信號對家蠶幼蟲絲腺細胞核內DNA復制的調控,也為進一步研究絲腺細胞高效核內有絲分裂的調控機制提供了新的方向。
【關鍵詞】：家蠶 絲腺 核內有絲分裂 激素 胰島素信號
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S881.24
【目錄】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 第一章 文獻綜述15-31
• 1.1 家蠶的生長發(fā)育與激素調控15-17
• 1.1.1 家蠶的生長發(fā)育15-16
• 1.1.2 家蠶的激素調控16-17
• 1.2 家蠶絲腺的發(fā)育17-18
• 1.2.1 家蠶絲腺組織特征17-18
• 1.2.2 激素與絲蛋白合成18
• 1.3 核內有絲分裂調控的研究18-25
• 1.3.1 細胞周期概述18-20
• 1.3.2 哺乳動物核內有絲分裂20-21
• 1.3.3 果蠅核內有絲分裂21-25
• 1.3.4 家蠶絲腺核內有絲分裂25
• 1.4 胰島素信號轉導的研究25-31
• 1.4.1 哺乳動物胰島素信號通路25-27
• 1.4.2 昆蟲胰島素信號通路27-28
• 1.4.3 果蠅胰島素信號通路與核內有絲分裂28-31
• 第二章 引言31-35
• 2.1 研究背景與目的意義31-32
• 2.2 主要研究內容32-33
• 2.3 主要技術路線33-35
• 第三章 激素和饑餓對家蠶幼蟲絲腺細胞核內有絲分裂的調控35-55
• 3.1 材料與方法35-42
• 3.1.1 實驗材料35
• 3.1.2 主要試劑及溶液配制35-37
• 3.1.3 主要儀器37-38
• 3.1.4 主要實驗方法38-42
• 3.2 結果與分析42-51
• 3.2.1 家蠶幼蟲期絲腺細胞DNA復制情況分析42-44
• 3.2.2 細胞周期相關基因mRNA在家蠶幼蟲絲腺組織中的表達分析44-45
• 3.2.3 蛻皮激素處理對家蠶幼蟲絲腺細胞DNA復制的影響45-47
• 3.2.4 保幼激素處理對家蠶幼蟲絲腺細胞DNA復制的影響47-48
• 3.2.5 營養(yǎng)對家蠶幼蟲絲腺細胞DNA復制的影響48-51
• 3.3 討論51-54
• 3.3.1 家蠶幼蟲期絲腺細胞DNA復制變化趨勢解析51-53
• 3.3.2 20E和饑餓抑制絲腺細胞DNA復制解析53-54
• 3.4 小結54-55
• 第四章 胰島素信號對家蠶幼蟲絲腺細胞核內有絲分裂的調控55-71
• 4.1 材料與方法55-59
• 4.1.1 實驗材料55
• 4.1.2 主要試劑及溶液配制55-57
• 4.1.3 主要儀器57
• 4.1.4 主要實驗方法及步驟57-59
• 4.2 結果與分析59-68
• 4.2.1 胰島素對家蠶幼蟲絲腺細胞DNA復制的影響60-61
• 4.2.2 LY294002、Rapamycin和U0126特異抑制劑處理后對絲腺細胞DNA復制的影響61-64
• 4.2.3 胰島素信號在絲腺細胞中的傳遞路徑64-66
• 4.2.4 20E對絲腺細胞PI3K信號通路和TOR信號通路的調控66-67
• 4.2.5 饑餓對絲腺細胞PI3K信號通路和TOR信號通路的調控67-68
• 4.3 討論68-70
• 4.3.1 胰島素激發(fā)家蠶幼蟲絲腺細胞DNA復制解析68-69
• 4.3.2 胰島素信號在絲腺中的傳遞路徑解析69-70
• 4.4 小結70-71
• 第五章 基于iTRAQ技術分析家蠶幼蟲眠期和盛食期絲腺組織差異表達蛋白71-99
• 5.1 材料與方法71-79
• 5.1.1 實驗材料71
• 5.1.2 主要試劑及溶液配制71-73
• 5.1.3 主要儀器73-74
• 5.1.4 主要實驗方法及步驟74-79
• 5.2 結果與分析79-95
• 5.2.1 家蠶幼蟲絲腺組織表達蛋白分析79-81
• 5.2.2 家蠶幼蟲眠期和盛食期絲腺組織差異表達蛋白分析81-82
• 5.2.3 差異蛋白的pathway富集分析82-83
• 5.2.4 細胞周期相關差異蛋白的組織表達譜分析83-86
• 5.2.5 BGIBMGA005826/BmADH基因克隆與序列分析86-88
• 5.2.6 BmADH基因在家蠶幼蟲期絲腺組織中表達水平分析88-89
• 5.2.7 BmADH基因的亞細胞定位89
• 5.2.8 干涉或過表達BmADH基因后對家蠶細胞DNA復制的影響89-92
• 5.2.9 干涉BmADH基因后對家蠶細胞TOR信號通路的影響92
• 5.2.10 20E對絲腺中BmADH基因表達的影響92-94
• 5.2.11 饑餓對絲腺中BmADH基因表達的影響94-95
• 5.3 討論95-98
• 5.4 小結98-99
• 第六章 綜合與結論99-101
• 論文創(chuàng)新點101-103
• 參考文獻103-117
• 附錄117-119
• 致謝119-121
• 在讀期間發(fā)表論文及參研課題情況121-122

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前3條

1 沈飛英;鐘伯雄;樓程富;洪波;蔣振東;蘇松坤;梁建設;徐海圣;;家蠶5齡幼蟲不同時期中部絲腺細胞蛋白質雙向電泳分析[J];蠶業(yè)科學;2006年01期

2 魯華云;葉鍵;李建營;鐘伯雄;;家蠶不同品種后部絲腺蛋白質雙向電泳圖譜比較[J];蠶業(yè)科學;2006年01期

3 吳衛(wèi)成;葉鍵;魯華云;李建營;陳金娥;孟智啟;倪春霄;鐘伯雄;;家蠶五齡第1天與第4天后部絲腺蛋白質雙向電泳圖譜比較[J];中國農業(yè)科學;2006年07期

  本文關鍵詞：家蠶幼蟲絲腺細胞核內有絲分裂的調控因素及相關蛋白的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：312768